【摘 要】
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近年来,我国草地毒草化日益严重,黄花棘豆极强的环境适应能力使其成为草原优势物种。课题组前期的研究表明黄花棘豆具有极强的抗旱能力,通过对干旱处理的黄花棘豆转录组数据分析显示OoABF2与OoLEA3基因显著上调表达,但其调控机理尚不清楚。因此本文以OoABF2和OoLEA3两个抗逆相关基因为研究对象,对二者的抗旱功能与调控关系进行解析,主要研究结果如下:（1）以F3代转基因拟南芥OoABF2-OEs
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近年来,我国草地毒草化日益严重,黄花棘豆极强的环境适应能力使其成为草原优势物种。课题组前期的研究表明黄花棘豆具有极强的抗旱能力,通过对干旱处理的黄花棘豆转录组数据分析显示OoABF2与OoLEA3基因显著上调表达,但其调控机理尚不清楚。因此本文以OoABF2和OoLEA3两个抗逆相关基因为研究对象,对二者的抗旱功能与调控关系进行解析,主要研究结果如下:（1）以F3代转基因拟南芥OoABF2-OEs和OoLEA3-OEs为研究对象,对其抗旱功能进行了分析。结果显示:OoABF2与OoLEA3基因的过表达均能减弱甘露醇模拟的干旱胁迫对拟南芥种子的萌发和幼苗生长的抑制作用,可减小离体叶片的失水率;对处于营养生长阶段的拟南芥自然失水20 d后,转基因拟南芥的存活率显著性高于野生型拟南芥;生理指标检测显示OoABF2和OoLEA3基因以提高拟南芥中脯氨酸含量和维持保护酶SOD、POD的活性及降低丙二醛含量。对拟南芥种子和幼苗经不同浓度的ABA处理之后发现,过表达OoABF2和OoLEA3使植株对ABA更加敏感;同时OoABF2基因对ABA应答基因AIL1,HIS1,KIN2,LEA76,RAB18,RD20,RD29A的表达具有正向作用。所有结果表明OoABF2和OoLEA3基因可能是通过ABA信号通路参与拟南芥对干旱胁迫的响应。（2）参考与黄花棘豆亲缘关系最近的物种蒺藜苜蓿基因组序列,利用同源克隆的方法克隆了OoLEA3基因669 bp启动子序列。通过启动子预测软件分析发现OoLEA3基因的启动子中含有两个ABRE元件（核心序列为ACGT）。（3）利用凝胶阻滞实验对OoABF2和OoLEA3的调控关系进行初步研究,结果显示:常规反应和突变探针冷竞争反应均出现典型的迁移带,而探针冷竞争反应的迁移带非常微弱,Super-shift反应出现迁移带和Super-shift两条带,仅含标记探针的阴性对照没有迁移带,同时所有反应均在底部出现大量的游离探针带。结果表明在体外环境中,OoABF2和OoLEA3的启动子序列存在相互作用,且相互作用的位点为ABRE顺式作用元件;（4）利用双荧光素酶报告基因实验对OoABF2和OoLEA3的调控关系在体内进行再次验证。结果显示含有p GreenⅡ0800-OoLEA3 promoter和p GreenⅡ62SKOoABF2重组质粒的农杆菌注射的烟草叶片中,报告基因LUC的活性约为内参Rluc的2.1倍,且显著高于对照组LUC的活性,表明在细胞体内OoABF2蛋白与OoLEA3基因的启动子序列存在相互作用,与EMSA结果相一致。
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