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路氏锥虫(Trypanosoma lewisi)是一种血液鞭毛虫,主要的中间宿主是褐家鼠(Rattus norvegicus)和屋顶鼠(Rattusrattus),通过跳蚤传播,呈全球性分布。长期以来,人们普遍认为路氏锥虫是一种宿主特异性极强的非致病性原虫。但是,这一观念目前正在受到挑战,因为人感染路氏锥虫的病例被陆续报道,且病人有明显的临床症状。路氏锥虫作为一种新的人兽共患病原体已引起世界卫生组织(World Health Organization)的重视。
目前检测路氏锥虫的方法主要是病原学检查,取血液涂片观察到虫体即可确诊。病原学检测准确率高,为诊断的金标准,但该法不便于大规模筛查,且灵敏度较低。因此,发展一种新的检测路氏锥虫的方法显得尤为重要。环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)有简单、快速高效、高特异性、高灵敏性和成本低等优点,适合流行病学的大规模筛查。
本论文率先建立了检测路氏锥虫的LAMP体系,明确了检测路氏锥虫的最佳反应温度为62℃,最佳反应时间是60min。对LAMP检测路氏锥虫的特异性和灵敏性进行了详细的研究,结果表明采用的引物对路氏锥虫有甚高的特异性,LAMP能检测到的DNA极限水平为10fg,普通PCR能检测到的DNA极限水平为100fg,LAMP检测路氏锥虫的灵敏度比普通PCR高10倍。此外,本研究结果证实,用FTA滤纸保存的血样无需作DNA纯化处理便可直接用于LAMP反应,结果与预处理的没有明显差异,但是未经处理的FTA滤纸保存的血样不能直接用于普通PCR反应。这表明LAMP反应对大分子有机物的耐受性要比普通PCR强。
本论文用三种方法检测了238只野生大鼠血样,结果表明:病原学检测(显微镜)阳性率为6.7%(16/238),PCR检测阳性率为12.6%(30/238),LAMP检测阳性率为18.9%(45/238),且病原学检测阳性样本在PCR和LAMP中均检测出阳性,PCR检测的阳性样本在LAMP中均检测出阳性。PCR检测的阳性率高于病原学检测,而LAMP检测的阳性率高于PCR检测。对比这三种方法,本文发现,LAMP检测路氏锥虫有更高的灵敏性,更适合用于路氏锥虫大样品量的流行病学研究。
本文利用FTA滤纸采集血液样本,结合LAMP技术检测路氏锥虫,建立了从样本采集、运输、贮存和检测于一体的一套完整LAMP检测体系。基于利用LAMP检测路氏锥虫的研究,本文的结果表明LAMP是一种快速、简便、成本低、高灵敏性和高特异性的检测路氏锥虫的方法,为人兽路氏锥虫病的检测提供了一种新的分子检测手段,对路氏锥虫的流行病学研究有重要意义。