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转录激活样效应因子（transcription activator-like effector,TALE）作为一种强有力的基因调控和基因组编辑工具,由于繁琐耗时的构建过程而被限制应用;同时,因为规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）的出现,并且CRISPR/Cas9（CRISPR/CRISPR-associated protein 9）的构建过程相对简单、构建周期也短,所以TALE曾被放弃应用。但是,TALE的高靶向性是最大的优势。为此,本研究开发了一种高效快速构建TALE转录因子（TALE-transcription factors,TALE-TFs）和TALE核酸酶（TALEN-nucleases,TALENs）的新方法,并且分别应用于肿瘤诱导分化疗法,基因编辑领域以及染色质免疫沉淀技术,都取得了富有成效的成果。1.高效构建TALE-TF用于肿瘤诱导分化疗法TALE一直是很有潜力的基因编辑和调控工具。然而,随着CRISPR/Cas9的出现,TALE因其耗时且效率低的构建过程而被放弃。但是,CRISPR/Cas9的脱靶效应已经限制了其体内应用。相比之下,由于TALE具有高靶向性,已经被允许在体内进行基因编辑和治疗。为了克服TALE技术的关键局限性,本研究开发了一种新的方法高效构建任何定制的TALE-TFs,创建了62种新的单体和一条新的构建流程,可在两天之内快速组装定制TALE-TFs。本研究通过组装靶向两个转录因子基因HNF4α和E47的启动子的9个TALE-TFs,验证了该新方法。在两种癌细胞Hep G2和PANC1中,TALE-TFs分别激活了两个内源基因HNF4α和E47的表达,从而促进了两种癌细胞分化成正常细胞。使用该新方法,可以像CRISPR一样快捷地构建定制的TALE-TFs,可以促进基于TALE技术的广泛应用。2.高效构建TALEN载体精准编辑NF-κB家族基因TALEN因其高靶向能力已在体内用于基因编辑和治疗。为此,本研究进一步优化了TALE的构建方案。该方案可在一天之内（约12小时）制备靶向任何18 bp靶点的TALEN,比CRISPR/Cas9构建速度更快。该方案使用了一组线性化单体、TALE-Fok I骨架质粒和新流程来组装即用型TALEN表达质粒,通过使用一对通用引物在96孔板中进行高保真PCR扩增可以生产和复制这些线性单体。最重要的是,新型的TALEN构建流程可以高效地获得许多阳性菌落（超过80%）。通过制备针对5个NF-κB家族基因（RELA、RELB、CREL、NFKB1、NFKB2）的5对TALEN实现在不同的细胞系（293T、Hep G2和PANC1）中编辑这些基因,这项研究表明,该新方法具有高效性和适用性。而且,制成的TALEN比CRISPR具有更高的编辑效率,以往检测编辑效率需要使用荧光定量PCR或者挑取单克隆细胞进行DNA测序,检测周期长且复杂。所以,本研究开发了一种用于标记目标蛋白的标记系统,并成功地以绿色荧光蛋白（Zs Green）同源性指导修复了NF-κB家族基因,可以实现编辑基因的可视化,使得检测编辑效率简单化。通过流式细胞仪成功筛选的被编辑的三种阳性细胞（293T、Hep G2、PANC1）,可广泛应用于基因调控和免疫治疗,也是理想的细胞模型。3.基于TALEN及同源修复的细胞及蛋白双标记系统基因编辑后使用抗生素筛选仍然是富集被编辑细胞的传统方法。但是,使用抗生素筛选阳性细胞毒性大且耗时,很难得到编辑成功的细胞。为此,基于前期开发的TALEN快速制备方案发明了一种用于同时标记目标蛋白和细胞的双标记系统,通过同源定向修复成功地使链霉亲和素结合短肽（SBP）或Avi Tag编辑了蛋白和细胞,不仅实现了被编辑基因的可视化,也成功在细胞膜表面展示多肽标签,实现了被编辑细胞的可视化,并且多肽标签可以特异性结合免疫链霉亲和素磁珠,有利于后期阳性细胞的筛选。同时,也比较了TALEN和CRISPR的编辑效率,发现TALEN比CRISPR具有更高的编辑效率。该系统可广泛用于蛋白质（抗原）制备,免疫沉淀和转录因子染色质免疫沉淀测定。4.基于TALEN建立的双标记系统用于ChIP-seq染色质免疫沉淀后再进行二代DNA测序（ChIP-seq）是一种广泛应用于识别人类基因组中转录因子（TF）的DNA结合位点的方法。但是,ChIP-seq受ChIP级抗体的限制,此外,绝大多数转录因子都没有相应的抗体。为了解决这些技术障碍,本研究提出了基于TALEN建立的双标记系统应用于ChIP-seq,使用该方法,有针对性的编辑可产生表位标记的转录因子NF-κB,它可被链霉亲和素免疫磁珠识别结合。通过在Hep G2细胞中标记NF-κB同源蛋白（RELA、RELB、CREL、NF-κB1、NF-κB2）来评估该系统的可行性。使用这种方法获得了RELA-DNA结合的经典基序,包括RELB、CREL、NF-κB1、NF-κB2的基序。这些数据突出了新方法在准确定义DNA结合蛋白在全基因组结合谱中的适用性,从而提供了一种简单的方法来测定潜在的TF的DNA结合位点,包括大部分无可用ChIP品质抗体的TF。此外,该双标记系统也可用于蛋白质互作的研究。总之,本论文开发的新方法,可以快速构建TALE-TFs和TALENs,并且TALE-TFs已经在肿瘤诱导分化疗法中成功将癌细胞转化为正常细胞;构建的TALENs也成功的编辑了NF-κB,并且通过新创建的蛋白和细胞双标记系统,应用于染色质免疫沉淀技术,得到了NF-κB的DNA结合谱。