AI是由禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)引起的一类禽传染病,通常只在禽类动物中传播流行,它的宿主范围非常广泛,主要宿主是水生野禽,家禽中火鸡和鸡也极易被感染,有时甚至可以感染哺乳类动物如人类、马和猪。尽管一些从人中分离到的禽流感病毒缺乏有效在人群中传播的能力,但自从1997年开始,人感染不同亚型禽流感病毒病例的相继出现,增加了禽流感病毒在人群中大规模流行的潜在可能性,近年来人类不断感染H5N1禽流感的事实更增加了它产生人类适应性从而大规模传播的可能性。因此,及时有效的开展流感病毒各亚型的鉴定工作对防止其大规模爆发而危害动物及人类生命安全具有重要意义。本研究借助实验室已有工作平台,首先对N3-N9亚型NA基因进行全长扩增,回收目的片段后与pFastHTA载体连接构建杆状病毒转移载体,扩大培养提取重组质粒pFastBacHTA-NAo然后将此重组质粒转化至DH10bac感受态细胞中构建杆状病毒穿梭载体,提取重组杆粒Bacmid-NA并转染sf9昆虫细胞获得N3-N9亚型NA重组蛋白。经过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白大小正确,神经氨酸酶实验结果为阳性。实验结果表明昆虫细胞sf9成功表达了各NA蛋白并具有神经氨酸酶活性,能够和相应的多克隆抗血清发生特异反应,为后期制备单因子血清、单克隆抗体,建立禽流感病毒诊断技术如神经氨酸酶抑制试验、抗体检测芯片技术等诊断方法奠定基础。研究期间恰逢国内H7N9禽流感的大爆发,在完成NA蛋白真核表达的同时建立了H7N9RT-PCR快速检测方法。首先根据H7N9亚型AIV HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立了H7N9亚型AIV的一步法RT-PCR检测方法。用背景清楚的流感病毒和其他病原评价了该方法的特异性,用系列稀释的H7N9病毒感染的尿囊液评价其敏感性。另外,采取双盲实验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。用H7亚型特异性引物检测H1-H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其它样品均为阴性；用N9亚型特异性引物检测N1-N9亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9亚型AIV样品有特异性目的条带,与其他N1～N9亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为104.5EID50/mL,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。该RT-PCR方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。