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目的一、本实验采用新生大鼠软骨细胞作为研究对象，构建Bax siRNA(smallinterfereing RNA,siRNA)，转染体外分离培养的大鼠软骨细胞，通过RT-PCR及Western blot检测其蛋白表达水平。二、应用siRNA干扰技术，沉默体外分离培养的软骨细胞中Bax基因的表达，旨研究Bax基因与软骨细胞凋亡的关系及其调控机制。方法清洁级出生5～7d的SD大鼠，雌雄不拘，断颈处死大鼠，剪下膝、髋关节软骨，于体外进行分离与培养1周左右，即可进行传代培养。传至第2代时，进行siRNA转染，实验分为对照组、Bax siRNA转染组和阴性对照转染组。更换不含血清及双抗的DMEM培养液，加入siRNA和lipofectamine2000混合液，置于CO2培养箱中温育4～6h，然后换成加入胎牛血清的培养液继续培养。收集实验各组细胞，制备成5×104/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每8孔细胞为1组。分对照组，Model组（加入2mmol/L硝普钠（SNP）作用24h），Model+BaxsiRNA组及Model+Control siRNA组。MTT法检测细胞活力，用酶联免疫检测仪在570nm处检测各孔的吸光度值。Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率；Western blot检测Bax Bcl-2、Cytochrome C蛋白的表达。结果一、干扰后Bax基因及蛋白表达水平的检测转染24h后Bax mRNA表达为1.03±0.153，对照组为1.836±0.164；蛋白质的表达为0.359±0.089，对照组为0.766±0.082，实验组较对照组明显下调，（P＜0.01）。二、Bax基因干扰后对细胞活力的影响对照组、Model组、Model+Bax siRNA组和Model+Control siRNA组的A570值分别为0.85±0.13、0.41±0.02、0.67±0.04和0.38±0.03。与Control组相比，Model组细胞A570值降低（P＜0.01）；与Model组相比，Model+Bax siRNA组细胞A570值增高（P＜0.01）；与Model+Bax siRNA组相比，Model+Control siRNA组细胞A570值降低（P＜0.01）。三、流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪检测结果显示对照组， Model组，Model+Bax siRNA组和Model+Control siRNA组细胞凋亡率分别为：2.87%、20.07%、9.21%和21.19%。其中Model组细胞的凋亡率远远高于对照组(P<0.01)；而Model+Bax siRNA组细胞凋亡率明显低于Model组(P<0.01)。四、Bcl-2及Cytochrome C蛋白表达水平的检测Bcl-2蛋白在Control组和Model+Bax siRNA组中呈现高表达，而在Model组和Model+Control siRNA组中Bcl-2蛋白的表达程度明显的降低（P<0.01）。然而，Cytochrome C蛋白在Control组和Model+Bax siRNA组中表达较弱，而在Model组和Model+Control siRNA组中表达程度明显的增强（P<0.01）。结论一、采用RNA干扰技术沉默Bax基因后，通过RT-PCR及Western blot分析Bax的mRNA及蛋白表达水平。Bax siRNA转染24h可以有效的沉默Bax基因和蛋白的表达。二、RNA干扰沉默Bax基因可抑制大鼠软骨细胞凋亡并且促进其存活，其机制可能与线粒体途径相关。