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研究背景皮肤是人的身体器官中最大的器官[1],位于人体表面,直接同外界环境接触,是人免疫系统的第一道防线,它不但可以保护人免于遭受外界微生物攻击,同时还具有排泄汗液、调节身体温度和感受外界环境刺激等作用[2],一旦发生重大事故,或者在其他情况下出现了大面积的皮肤缺损,无法自行愈合,为保护创面及防治感染,临床上通常需要进行皮肤移植来促进伤口创面恢复。同种异体生物进行皮肤移植时,移植物作为外来抗原,会激发受体产生免疫排斥反应[3]。研究表明,受体血清中针对移植物的抗体和移植物MHC分子在免疫排斥中有重要的作用[6],之前文献证实,朗格汉斯细胞是诱导免疫排斥反应的主要免疫细胞,但最近几年研究表明,由于T淋巴细胞表达丰富的MHC-I类分子,所以淋巴细胞在免疫排斥反应中的作用至关重要[7]。移植物进入动物机体后,移植物的MHC抗原经抗原提呈细胞致敏受体免疫细胞,促使被激活的T淋巴细胞产生多种细胞因子[8-10],来识别移植物细胞并引起免疫排斥反应。如果在异体移植时不能同时应用抑制机体发生免疫排斥反应的抑制剂,就会导致移植皮肤被受体免疫细胞攻击进而坏死。传统的免疫抑制剂,如环孢素A、环磷酰胺、他克莫司、吗替麦考酚酯等,主要通过抑制淋巴细胞生长分化,从而达到抑制免疫排斥发生的目的[4,5],长期应用会造成诸多不良反应,如肝肾毒性,及身体免疫系统减弱而产生的其他肿瘤等疾病。因此寻找全新作用机制且高效低毒的免疫抑制剂可能为抗异体皮肤移植排斥反应的临床治疗提供新思路。CX-5461是一种新型的特异性抑制RNA聚合酶I(POL I)的新型药物[6]。以往研究证实,CX-5461可以用作一种抗肿瘤药物,它能够通过p53-非依赖途径特异性诱导某些淋巴系统白血病、人结直肠癌、黑色素瘤和胰腺癌等肿瘤细胞的自噬和衰老,对这些疾病有良好的治疗效果。根据课题组前期研究中得知,CX-5461对银屑病这种常见的慢性免疫炎症性增生性皮肤病有良好的治疗效果,CX-5461可以显著抑制由球囊损伤导致的动脉内膜增生[7],对血管移植术后巨噬细胞介导血管炎症和增生的血管新生内膜的进展也有抑制作用,并且我们还研究了 CX-5461对心肌成纤维细胞的作用,发现这种药物可以抑制干预心肌成纤维细胞的表型转化及活化[8,9]。但是是否对皮肤移植产生的免疫排斥反应有抑制作用目前还没有研究。研究目的1.探索RNA聚合酶I(POL I)特异性抑制剂CX-5461是否能抑制T淋巴细胞增殖及T淋巴细胞活化后炎症因子的表达和分泌。2.探索RNA聚合酶I(POL I)特异性抑制剂CX-5461是否能抑制小鼠异系皮肤移植引起的免疫排斥反应。研究方法一、体内(动物)实验取BALB/c小鼠40只,C57BL/6小鼠30只。随机取出其中10只BALB/c小鼠做自体皮肤移植模型,作为Sham组。将剩余的BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠做异系皮肤移植模型,将皮肤移植后BALB/c小鼠随机分成三组:(1)Control组,(2)CX-5461组,(3)CMC-Na组。Control组小鼠不进行灌胃处理,将CX-5461溶解到CMC-Na(羧甲基纤维素钠)中,对CX-5461组实验小鼠给予9.025mg/Kg剂量的灌胃给药。CMC-Na组小鼠给予相同剂量的CMC-Na灌胃处理。将小鼠按照实验要求处理,12天后,将移植皮片取下进行病理学检测,观察移植皮片的病理学改变。二、体外(细胞)实验培养Jurkat T淋巴细胞系。将Jurkat T淋巴细胞分成四组:1.Control组细胞2.CX-5461组:2 uM浓度的CX-5461处理细胞3.PI组:用佛波酯离子霉素合剂(50ng/ml+0.5 uM)刺激Jurkat T淋巴细胞进行活化。4.CX-5461+PI组:2 uM浓度的CX-5461和浓度为50ng/ml+0.5 uM的佛波酯离子霉素合剂处理的细胞用Cell Counting Kit-8(CCK-8)测试细胞增殖,用实时定量PCR方法检测肿瘤坏死因子-β、白细胞介素的表达及干扰素的基因表达。用蛋白印记法测量TNF-β、IL-2和IFN-γ及β-actain蛋白的表达量及ELISA法检测IL-2的胞外分泌情况。研究结果1.在小鼠皮肤移植试验模型中,我们发现CX-5461可明显改善皮肤移植引起的皮肤皱缩变黑及脱落。2.HE染色结果显示,与Control组相比,CX-5461治疗明显抑制了免疫排斥反应引起的炎症细胞的增生和聚集。另外我们发现CX-5461能够减轻病变部位的炎症反应。与对照组相比,CX-5461治疗组皮肤炎症细胞浸润数量明显减少。3.在细胞实验中,Cell Counting Kit-8(CCK-8)结果显示,CX-5461处理组,细胞数量明显降低。4.实时定量PCR结果显示CX-5461治疗组IFN-γ、TNF-β、IL-2的表达明显下降。5.蛋白印记法测量TNF-β、IL-2和IFN-y蛋白的表达量也下降。6.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在细胞分泌的上清液中,CX-5461处理组的IL-2分泌明显减少。研究结论1.CX-5461可以有效抑制皮肤移植引起的急性免疫排斥反应的发生发展,减轻炎细胞浸润和病变部位的坏死脱落。2.CX-5461抑制免疫排斥反应的作用可能与抑制反应性T淋巴细胞的增殖和一系列细胞因子的分泌有关。