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目的:本课题组前期实验发现F-box蛋白7（F-box protein 7,FBXO7）在人肝癌细胞株中的表达高于其在人正常肝细胞株中的表达。在人肝癌细胞HepG2、SMMC7721中,沉默FBXO7抑制细胞的体外增殖、迁移、侵袭,抑制细胞周期G1/S期转换,促进细胞自噬,以上结果表明在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）中FBXO7扮演癌基因的角色。叉头盒蛋白D3（Forkhead box D3,Foxd3）是叉头盒（Fox）转录因子家族的成员之一,Fox蛋白是一个进化保守的转录因子家族,介导广泛的生物学过程。目前研究发现,Foxd3在多种肿瘤的发生和进展中都作为转录抑制因子发挥转录调控作用。本课题通过生物信息学软件（www.genome.jp/kegg/pathway.html）预测并综合评估,发现Foxd3是FBXO7的潜在转录调控因子,但两者在肝细胞癌中的关系及机制尚未明确。本实验目的在于,初步探讨在人肝癌细胞HepG2和SMMC7721中,Foxd3调控FBXO7对细胞体外生物学行为的影响,以进一步明确FBXO7在肝细胞癌中可能的作用机制和途径,从而为肝细胞癌的发生发展机制提供更多的理论依据。方法:1.在人肝癌细胞HepG2、SMMC7721中通过脂质体转染Foxd3-SiRNA以沉默Foxd3,利用Real-time PCR和Western Blot检测Foxd3的沉默效率以及FBXO7的mRNA和蛋白表达水平,并检测共同转染SiFoxd3+SiFBXO7后FBXO7的mRNA和蛋白表达水平。2.CCK-8法检测沉默Foxd3及共同沉默Foxd3+FBXO7对人肝癌细胞HepG2、SMMC7721体外增殖能力的影响。3.平板克隆形成实验检测沉默Foxd3及共同沉默Foxd3+FBXO7对人肝癌细胞HepG2、SMMC7721体外克隆形成能力的影响。4.划痕实验检测沉默Foxd3及共同沉默Foxd3+FBXO7对人肝癌细胞HepG2、SMMC7721体外迁移能力的影响。5.Transwell侵袭实验检测沉默Foxd3及共同沉默Foxd3+FBXO7对人肝癌细胞HepG2、SMMC7721体外侵袭能力的影响。6.流式细胞仪检测沉默Foxd3及共同沉默Foxd3+FBXO7对人肝癌细胞HepG2、SMMC7721细胞周期的影响。7.Western Blot和细胞免疫荧光检测沉默Foxd3及共同沉默Foxd3+FBXO7后人肝癌细胞HepG2、SMMC7721自噬的变化。结果:1.Real-time PCR及Western Blot结果显示,与对照组相比,在人肝癌细胞HepG2、SMMC7721中有效沉默Foxd3显著增强了FBXO7的mRNA及蛋白表达水平（P<0.05）;然而,共同沉默Foxd3+FBXO7能有效的逆转FBXO7的表达（P<0.05）。2.CCK-8细胞增殖实验结果显示,在HepG2、SMMC7721细胞中,与对照组相比,Foxd3沉默组细胞的体外增殖能力增强（P<0.05）;与Foxd3沉默组相比,Foxd3+FBXO7共同沉默组有效的逆转了细胞体外增殖能力（P<0.05）。3.平板克隆形成实验结果显示,在HepG2、SMMC7721细胞中,与对照组相比,Foxd3沉默组细胞体外克隆形成能力增加（P<0.05）;与Foxd3沉默组相比,Foxd3+FBXO7共同沉默组有效的逆转了细胞体外克隆形成能力（P<0.05）。4.划痕实验结果显示,在HepG2、SMMC7721细胞中,与对照组相比,Foxd3沉默组中细胞体外迁移能力明显增强（P<0.05）;与Foxd3沉默组相比,Foxd3+FBXO7共同沉默组有效的逆转了细胞体外迁移能力（P<0.05）。5.Transwell侵袭实验结果显示,在HepG2、SMMC7721细胞中,与对照组相比,Foxd3沉默组体外侵袭能力明显增加（P<0.05）;与Foxd3沉默组相比,Foxd3+FBXO7共同沉默组有效的逆转了细胞体外侵袭能力（P<0.05）。6.流式细胞仪检测结果显示,在HepG2、SMMC7721细胞中,与对照组相比,Foxd3沉默组的细胞G1期比例减少,S期比例增加（P<0.05）;在HepG2细胞中,Foxd3沉默组与Foxd3+FBXO7共同沉默组之间无明显差异（P>0.05）;而在SMMC7721细胞中,与Foxd3沉默组相比,Foxd3+FBXO7共同沉默组有效的逆转了细胞G1/S期转换（P<0.05）。7.Western Blot和细胞免疫荧光结果显示,在HepG2、SMMC7721细胞中,与对照组相比,Foxd3沉默组细胞自噬显著降低;与Foxd3沉默组相比,Foxd3+FBXO7共同沉默组有效恢复了肝癌细胞的自噬。结论:1.在人肝癌细胞HepG2、SMMC7721中有效沉默Foxd3后显著增强了FBXO7的mRNA和蛋白表达水平,而共同沉默Foxd3+FBXO7能有效的逆转FBXO7的表达,因此,Foxd3可能在人肝癌细胞中负调控FBXO7的表达。2.在人肝癌细胞HepG2、SMMC7721中,沉默Foxd3增强细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力,而共同沉默Foxd3+FBXO7可以有效的逆转细胞体外增殖、迁移及侵袭能力。Foxd3/FBXO7可能存在于同一调控通路中,影响人肝癌细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力。3.沉默Foxd3促进人肝癌细胞HepG2、SMMC7721的细胞周期由G1期向S期转换,共同沉默Foxd3+FBXO7对HepG2细胞周期转换无明显影响,但可以逆转SMMC7721细胞的G1/S期转换。Foxd3和FBXO7对HepG2、SMMC7721细胞周期转换的影响不一致,提示Foxd3/FBXO7对人肝癌细胞周期的影响可能具有细胞特异性。4.沉默Foxd3降低了人肝癌细胞HepG2、SMMC7721的自噬,共同沉默Foxd3+FBXO7可以有效的恢复人肝癌细胞的自噬,Foxd3/FBXO7可能在人肝癌细胞的自噬调节中共同发挥作用。