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前言：
DEK是一种原癌基因,定位在6p22.3染色体,在急性髓系白血病(AML)的一亚型中第一次被报道。研究发现在多种肿瘤如视网膜母细胞瘤、肝细胞癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤以及成年人急性白血病中,DEK蛋白均出现过表达。DEK能部分抑制细胞的分化和过早衰老,并与恶性细胞抗凋亡相关。这些研究提示DEK在肿瘤细胞中有多种功能,是一个重要癌基因。
但是DEK在非小细胞肺癌中的表达情况与临床病理因素的关系还不清楚,其对肺癌细胞的作用及其作用机制未见文献报道。我们检测非小细胞肺癌中DEK的表达情况,分析了DEK表达与临床病理因素的关系,通过干扰肺癌细胞系A549,SPC中DEK的基因表达,探讨了DEK对非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡影响。
材料与方法：
1、组织来源
112例原发性非小细胞肺癌标本及38例相应正常肺组织标本来自中国医科大学附属第一医院病理科存档蜡块,患者术前均未接受放化疗。男性72例,女性40例,年龄36～76岁,平均年龄61岁。按2004年WHO肺肿瘤组织学分类标准:鳞癌48例,腺癌64例;高分化41例,中分化47例,低分化24例,有淋巴结转移43例,无淋巴结转移69例。依据国际抗癌联盟(UICC)修订的肺癌TNM分期标准:Ⅰ期55例,Ⅱ期33例,Ⅲ期24例。
2、免疫组织化学染色
免疫组化检测试剂盒和浓缩型DAB试剂盒为福建迈新生物工程有限公司产品,DEK多克隆抗体为ProteinTechGroup中国分公司一武汉三鹰生物技术有限公司产品。操作步骤简略为:将石蜡组织块切成4μm厚的切片,脱蜡,脱水,在柠檬酸盐抗原修复液中修复后,按SP法操作步骤进行,一抗用抗DEK的多克隆抗体(1:200)4℃孵育过夜,生物素标记的二抗37℃孵育30分钟,DAB显色,苏木素染色。为证明DEK蛋白抗体免疫组化检测的特异性,实验中以鼠IgG代替一抗作为对照,结果阴性。同时,选择DEK蛋白阳性染色的切片,以PBS代替一抗的染色结果为阴性作为可信的实验依据。
3、免疫组化结果判定标准
结果判定:以棕褐色颗粒位于细胞核内判定为DEK阳性染色结果。并根据Beesley分级法,按阳性细胞数的比例将染色结果分为4级。0级:阳性细胞数为0～5%;1级:阳性细胞数为6%～25%;2级:阳性细胞数为26%～50%;3级:阳性细胞数为50%以上。同时,计算阳性率的方法设定为:(1)阳性率:指1级和1级以上的阳性染色病例百分数;(2)强阳性率:指2级和2级以上的阳性染色病例百分数。
4、细胞培养和siRNA干扰
人肺腺癌A549细胞系用含有10%胎牛血清和100U/mL青链霉素的DMEM培养基,肺癌细胞系SPC用含有10%胎牛血清和100U/mL青链霉素的1640培养基培养,均在37℃,5%CO2条件的培养箱内培养。
转染前24小时将细胞按50%密度接种于6孔板,采用DharmaFECT1转染试剂进行转染,转染48小时后使用PCR和Westernblot检测干扰效率。
5、RT-PCR
对于培养的细胞或者剪碎的组织利用Trizol试剂(Invitrogen,USA)裂解,然后按照说明书的步骤,提取总的RNA。我们使用AMVVer3.0(Takara,Shiga,Japan)试剂盒。PCR产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳,采用(ImageJ)Bio-ImagingSystem进行灰度值测定,以β-actin作为内参。
6、WesternBlot法检测蛋白表达
收集细胞加入裂解液充分裂解,低温高速离心(4℃,15000转/min,15min),提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60μg。电泳(10%SDS-PAGE凝胶)、转印(50V,90min)、5%正常小牛血清封闭,抗DEK(1:2000,proteinTech)和抗β-actin(1:500),4℃孵育过夜,分别与对应的二抗(1:4000,santacruz,USA)室温孵育2h,ECL显色,结果经自动电泳凝胶成像分析仪(ChemiImager5500,AlphaInnotech,USA)采集,进行灰度值测定。
7、MTT法检测细胞增殖及集落形成实验
将单个细胞悬液接种于96孔培养板中,每孔体积100μl含3.5×103个细胞,培养24hr,每孔加入MTT(3-[4,5-2-y1]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)溶液(5mg/ml,Sigma,USA)继续培养4hr,吸去上清液,加入150ulDMSO(Sigma,USA),振荡10min,490nm波长下测定各孔光吸收值,以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线。集落形成实验在干扰48小时后接种400个细胞于6cm培养皿中2周后用苏木素染色.
8、数据分析
采用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析,对DEK表达和临床病理因素的关系用卡方检验;采用t检验检测RT-PCR和WesternBlot结果中的灰度值。以P＜0.05为差异有意义。
结果：
1、DEK在非小细胞肺癌中过表达
我们采用免疫组化的方法检测了DEK蛋白在112例非小细胞肺癌组织及38例癌旁正常肺组织中的表达情况。在正常的肺组织中DEK的表达为阴性,38例正常支气管上皮DEK表达均为阴性。在112例非小细胞肺癌中,DEK的阳性表达率为58.9%(66/112),肺鳞状细胞癌DEK的阳性表达率为47.9%(23/48),肺腺癌中DEK阳性表达率为67.2%(43/64),阳性信号主要表达于肿瘤细胞细胞核中。与正常组织相比,DEK蛋白在肺癌组织中表达率明显增高,而且染色强度明显增强,具有统计学差异(P＜0.05)。
2、DEK在非小细胞肺癌中与临床病理因素相关
对非小细胞肺癌中DEK表达与临床病理因素关系进行统计分析,我们发现DEK的阳性表达与年龄、性别、肿瘤大小无显著关系。DEK的表达与病理组织学分型有关,腺癌中的表达阳性率明显高于鳞癌,有统计学意义(p=0.040)。DEK的阳性表达与肺癌的分化(p=0.001),淋巴结转移(p=0.025),p-TNM分期(p=0.017)有着显著关系。
3、在两种肺癌细胞系中转染DEK特异性siRNA抑制肺癌细胞的增殖
我们检测了7种非小细胞肺癌细胞系中DEK蛋白的表达情况,为了进一步研究DEK的功能,选出肺癌细胞系A549和SPC,然后我们采用DEK特异性的siRNA干扰其在上述两种细胞中的表达。转染48小时后,与转染乱序siRNA的细胞相比,转染特异性干扰的细胞DEK的表达明显下降(其中A549干扰效率71%;SPC干扰效率66%)。MTT法测定结果显示,DEK特异性siRNA转染的细胞增殖能力明显低于对照组(P＜0.05)(可以看到第二天开始转染组与对照组相比,增殖能力下降)。与MTT结果相似,干扰DEK后,A549和SPC细胞的集落数目明显下降,对照组比实验组:A549:(127+-14vs77+-9),SPC(178+-19vs94+-13)。
结论：
1、DEK在非小细胞肺癌组织中过表达,并且其过表达与肺癌的分化,组织学分型,淋巴结转移和TNM分期相关。
2、下调DEK表达能够抑制肺癌细胞的增殖能力。