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前言 肝脏是人体重要的实质器官，具有合成与储存养料、分泌胆汁、解毒和防御等维持生命活动所必需的多种生理功能。然而肝脏又极易受到多种物质的损伤，一旦受到损伤或出现病变，将严重影响机体的功能，甚至威胁生命。因此，对肝脏保护和再生功能的研究，具有非常重要的理论和实际意义。人肝刺激因子(human hepatic stimulator substance，hHSS)是一种新发现的肝脏的促生长因子。它能促进肝细胞和肝肿瘤细胞的再生。因此，hHSS在肝脏细胞增殖方面起重要作用。大量基因学研究表明，肝再生本身系众多生长因子和细胞因子作用于细胞膜，通过复杂的信号传导，最终启动相关靶基因表达的精细调节过程，而靶基因启动子活性状态对基因表达调控起重要作用。此外，鉴于hHSS对肝再生过程中所起的重要作用，对其基因水平的研究更有利于肝脏组织工程的发展。自hHSS发现以来，对它的提纯，理化性质，生物活性，作用机理以及临床应用已有长足进展，但是hHSS基因的转录方式目前知之甚少。本实验中，分析克隆hHSS基因5′-侧翼序列，通过RT-PCR和5′RACE确定其转录起始位点，并利用hHSS基因5′-侧翼序列-LacZ嵌合体报告基因体系瞬时转染HepG2和3T3细胞系，初步确定该基因5′-侧翼序列中某些潜在的正负调控原件。通过电泳泳动迁移实验(electrophoresis mobility shift assay，EMSA)证实hHSS基因5′-侧翼序列内的特定区域能和核蛋白结合且含有与转录因子(如AP1，AP2，SP1)结合的序列。对于阐明hHSS的转录及转录后的调节与作用机制具有重要意义。实验材料 1)质粒PET42a(+):为本实验室构建的hHSS基因原核表达质粒; 2)新鲜胚胎肝组织 3)HePGZ细胞系:人肝细胞癌细胞 3竹细胞系:鼠成纤维母细胞 4)5’RACE试剂盒美国玩vitrogen公司 5) pBlueTOPOTA表达试剂盒美国Invi加gen公司 6)p一Gd试剂盒美国Invitrogen公司实验方法 l)筛查基因组文库 2)Southem blot分析，限制性内切酶分析，PCR，测序 3)RT一PCR(reversetranseriptase一砂lymerase ehain reaetion)和5‘RACE(5‘ranid amp肪eation eDNA end) 4)八个由PCR生成的连续的5’删除体被插人报告基因(UcZ)上游形成重组质粒，瞬时转染到HePGZ和3竹细胞系。检测重组质粒p一半乳糖昔酶活性。 5)电泳泳动迁移实验(eleetrophoresis mobility shiftas卿，EMSA-)结果 分离克隆hHSS基因5‘一侧翼序列4890bp。通过确定hHSS基因转录起始位点位于第I外显子上游254饰处，起始碱基为”C”。5’非翻译区(5’一UTR)为254坤。这个区域没有经典的TA-TA或GAATT盒，但在第I外显子上游近端存在一段高GC含量(>70%)序列(>400bp)。利用hHsS基因5‘一侧翼序列一ucz嵌合体报告基因体系瞬时转染HePGZ和3竹细胞系，初步确定该基因5’一侧翼序列中的启动子活性和某些潜在的正负调控元件。结果显示，一577一料1(HePGZ细胞系)，一876一577和-一865一1075(3竹细胞系)，和一2872一1865(两个细胞系)对hHss表达有正调控作用，也就是说，促进基因表达。在这些区域中还有很多潜在的促肝脏生长的顺式作用元件序列，如激活蛋白l(AP1)，激活蛋白2(A咒)，激活蛋白4(AP4)，肝细胞核因子一3(HNF一3)和核因子一1(NF一1)。还找到了两个负调控元件，分别位于一441一246(两个细胞系)，一1075一876(3竹细胞系)。删除这些片段能引起p一半乳糖昔酶活性的升高。电泳泳动迁移实验(elee加phoresis mobUity shift assay，EMSA)证实了hH-Ss基因5‘一侧翼序列内的启动子活性。而且一些特定区域含有与转录调节有关的顺式作用元件，如促进转录的SPI结合序列和一些未知的转录抑制元件。hHsS基因的启动子可能位于hHSS基因一2872至+104区间。讨论 一、hHSS基因5’一侧翼序列的结构分析 本实验首次分析克隆了hHSS基因第I外显子5‘一侧翼4890bpDNA序列。未发现经典的TATA序列。在第I外显子上游近端区域有一段很长的(>400bp)富含GC的序列(>70%)。已知几种缺乏经典TATA和GAATT盒的管家基因启动子同样也含有一段高GC含量的区域。通过RT一PcR和5‘RAcE确定hHSS基因的转录起始位点，位于第I外显子上游254bp处。hHSs基因5‘非翻译区(5‘一UTR)为254bP。然而，起始碱基是”C”，这在真核启动子中不太常见。与GenBank对照，发现这段序列与人1 6pl3.3一段序列高度同源。因此认为号染色体上。hHsS基因定位于人第16二hHSS基因5’一侧翼序列的功能分析hHSS基因一系列不同长度的5‘删除后的5‘一侧翼序列均能在缺少经典TATA盒的情况卜驱动h助勺全四位。eP、，儿一二胞系中表达。这项结果显示hHsS基因不是肝组织特异性基因，在各组织细胞中具有表达。存在至少两个负调控元件和四个正调控元件。删除这些区域能引起hHSS基因启动子活性的改变。然而，两种细胞系的表达确实有所不同，即使是同一序列在不同细胞系中也有不同的作用。可以推断在不同细胞系的启动子含有不同的正负调控元件。 通过