衰老与肿瘤是人类疾病研究中的重要问题,二者都与细胞累积性损伤及DNA损伤应答相关基因的调控有关。p53作为一个非常重要的抑癌基因,它的突变不仅会导致其抑制癌症的功能丧失,某些突变类型的p53还可能会与某些肿瘤的发生有关,例如急性髓性白血病的发病等。另外,p53基因的突变甚至会导致其获得促进肿瘤生长的功能,这些可统称为突变p53的功能获得(Gain-of-Function,GOF)。已有研究显示,人类的肿瘤大约有一半都携带了突变的TP53基因。与p53一样,端粒酶也在肿瘤和衰老的发生发展过程中起着重要的作用。人类的很多肿瘤中可以同时检测到p53基因的突变和端粒酶的重激活。当细胞端粒功能异常时,正常的p53能够启动DNA损伤应激反应,使细胞进入衰老或凋亡程序;但是突变型的p53可能丧失这一功能,从而使细胞逃逸衰老或凋亡,提高存活率,增大了染色体重排等异常事件的发生几率,进而可能导致肿瘤的发生。因此,研究p53突变对端粒功能异常产生衰老的调控作用,对于明确突变p53对端粒功能异常情况下衰老和肿瘤进程的调控机制、寻找科学抗衰老策略及针对p53突变和端粒功能异常肿瘤的诊断和治疗方法等有着重要的意义。早老综合症(Werner Syndrome,WS)小鼠模型是通过双敲出mTerc与Wrn基因构建的,该小鼠模型忠实再现了人类早老综合症症状。本实验室前期从该小鼠模型第五代(G5mTR-/-Wrn-/-)小鼠胚胎成纤维母细胞产生的永生化细胞中,发现在能产生肿瘤的细胞株中p53发生了同一个点突变:p53N236S(在人类中是p53N239S,以下简称p53S),继而在细胞水平的研究发现,p53N236S不仅丧失了调控细胞周期阻滞、凋亡的功能,还能与Ras原癌基因协同作用,促进肿瘤的形成。之后实验室建立了 p53S基因敲入小鼠模型,进一步在动物水平上研究了 p53S的功能缺失和功能获得。实验室前期研究发现,p53S小鼠多发淋巴瘤(56%),少部分罹患骨肉瘤(26%),且骨肉瘤表现出较高的转移性。提示p53S是一个较为严重有致癌潜能的突变。已有研究显示,p53在造血干细胞的细胞周期中起到了负调控的作用,p53敲除的小鼠较野生型小鼠表现出了造血干细胞的显著增加,且p53突变则更易引起造血干细胞基因组的不稳定,从而引发白血病等肿瘤的发生。人类有13%左右的血液系统肿瘤均存在p53基因的突变,且p53基因的异常与白血病的发展及预后等密切相关。本研究首先研究p53S小鼠的造血表型,为探究其在淋巴系统已受影响的情况下是否同时有造血系统疾病的发生奠定基础。并在WS小鼠模型的背景下,研究p53S对早老综合症小鼠的早衰的调控情况,拟初步揭示点突变p53S与端粒功能异常之间的相互关系,并为科学抗衰老或寻求新的肿瘤防治靶点提供初步理论依据奠定基础。首先,我们运用小鼠骨髓细胞LSK(Lin-sca+c-kit+)分析法,对p53s/s小鼠的骨髓造血干细胞进行了群落分布的分析,并将所得结果与WT小鼠情况进行比较。以研究p53S对造血干细胞的影响。结果显示,p53S小鼠的骨髓造血干细胞比率较WT小鼠有了明显增高,提示p53S可能丧失了负调控造血干细胞由静息状态到G1期的功能,在造血干细胞由静息状态到G1期的转变中丧失了野生型p53具有的负调控功能。另一方面,为了进一步研究p53S对早老综合症小鼠衰老的调控作用,我们通过杂交的方式,在早老综合症小鼠模型(WS小鼠模型)中引入了 p53S,由此形成mTR-/-Wrn-/-p53S基因型小鼠。进而在WS小鼠模型的背景下,研究p53S对早老综合症小鼠的早衰表型和DNA损伤应激相关通路及代谢相关通路的调控情况。我们利用了免疫荧光染色、Real-time PCR和Western Blot技术检测了mTR-/-Wrn-/p53s/sMEF(小鼠胚胎成纤维细胞)细胞DNA损伤情况、p53及下游细胞周期抑制蛋白p21、凋亡标志分子puma基因和蛋白的表达水平。结果发现,G1mTR-/-Wrn-/-p53s/s小鼠 MEF 细胞的 DNA 损伤较WT、G1mTR-/-Wrn-/-、G3mTR-/-Wrn-/-细胞都要严重,并且荧光实时定量PCR及Western blot实验数据显示,mTn-/-Wrn-/-p53s/sMEF细胞中,p53的表达量均较WT及G1mTR-/-Wrn-/、G3mTR-/-Wrn-/-细胞显著升高,但p21及puma的表达量却是显著降低的。这表明,位于经典DNA损伤信号通路中的肿瘤抑制基因p53是被激活的,但其却几乎失去了调控p21及puma表达的功能。此外,细胞增殖数据也表明,G1mTR-/-Wrn-/-p53s/sMEF的增殖速度较WT及G1mTR-/-Wrn-/-细胞、G3mTR-/-Wrn-/-细胞显著加快。这表明,p53S在WS细胞中几乎丧失了调控细胞周期阻滞及细胞凋亡的功能,并缓解WS细胞原有的细胞周期阻滞,提示其有可能逆转细胞的衰老。同时我们也发现,G1mTR-/-Wrn-/-p53s/sMEF细胞中sirtl的表达量较WT及G1mTR-/-Wrn-/-、G3mTR-/-Wrn-/-MEF细胞显著降低,而G1mTR-/-Wrn-/-p53s/sMEF细胞中PGC1-α的表达量又较WT及G1mTR-/-Wrn-/-、G3mTR-T-/Wrn-/-MEF细胞有所升高。且ROS的数据显示,G1mTR-/-Wrn-/-p53s/sMEF细胞的ROS水平较野生型细胞及G1mTR-/-Wrn-/-、G3mTR-/-Wrn-/-MEF细胞明显下降。这表明,p53S可能通过影响sirt1及PGC1-α通路从而影响了 WS细胞的表型而使WS细胞逆转衰老,并可能保持有较好的线粒体功能。综上所述,本论文研究发现,p53S能使小鼠造血干细胞增多,这为后期研究p53S小鼠是否罹患造血系统疾病提供了线索。此外,本论文在mTR-/-Wrn-/-p53S模型的细胞水平上,初步研究了 p53S调控WSMEF细胞衰老的相关分子机制,发现p53S能使WS细胞的衰老情况得到一定情况的逆转,甚至有可能使细胞发生永生化的现象,为我们研究衰老与肿瘤的关系提供了初步的理论根据。