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[目 的]采用37℃恒温干燥箱风干羊膜,经液氮预冷后研磨制备新型羊膜粉,将新型羊膜粉与纤维蛋白胶结合制成羊膜-纤维蛋白(AM-FS)胶泥,利用体外细胞实验研究含不同浓度新型羊膜粉的AM-FS胶泥对兔角膜上皮细胞增殖的影响,结合在体动物实验研究AM-FS胶泥在兔重度眼表碱烧伤模型中的治疗效果。[方 法]制备新型羊膜粉:将洗净的新鲜羊膜置于37℃恒温干燥箱风干,液氮预冷后研磨成直径<260um的新型羊膜粉,γ射线灭菌;用生长因子芯片检测并比较新型羊膜粉及新鲜羊膜中bFGF、TGF β、NGF R、HGF、EGF的表达;根据保存条件将新型羊膜粉分为三组(室温保存组、4℃保存组、-20℃保存组),每隔10d、20d、30d重复检测并比较生长因子的表达情况,探索新型羊膜粉的最佳保存方法。体外细胞实验:配制含不同新型羊膜粉浓度的AM-FS胶泥(65mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、Omg/ml),将培养至第二代的兔角膜上皮细胞分别接种在铺有以上胶泥的细胞培养板底部,在显微镜下观察角膜上皮细胞的生长密度,结合CCK-8检测含不同浓度新型羊膜粉的AM-FS胶泥对细胞增殖的影响,筛选出AM-FS胶泥中羊膜粉的适宜添加浓度。动物实验:将在1mol/ml氢氧化钠溶液中浸泡过的圆形滤纸片(直径为15mm)置于兔角膜表面60s,随后立即用大量生理盐水迅速冲洗受损角膜及周围组织,制作兔重度眼表碱烧伤模型,按照治疗方式不同将模型动物随机分为四组(AM-FS胶泥组、新鲜羊膜移植组、纤维蛋白胶(FS)组、实验对照组)每组8只,术后7d、14d、21d、28d分别行裂隙灯显微镜检查、荧光素钠角膜染色观察角膜修复情况,第28d取材、固定角膜分别行HE染色,免疫组织化学法检测mcp-1、VEGF在角膜中的表达情况。[结 果]检测并比较新型羊膜粉及新鲜羊膜中bFGF、TGF β、NGF R、HGF、EGF的表达,结果显示:新型羊膜粉中NGF R的表达量低于新鲜羊膜,bFGF、HGF、EGF在新型羊膜粉中的表达量均高于新鲜羊膜,差异均具有统计学意义(adj.P.Val<0.05且logFC>0.263),TGF β在新型羊膜粉的表达量与新鲜羊膜组相比差异无统计学意义(logFC<0.263);将新型羊膜粉分别于室温、4℃、-20℃下保存,分别检测不同时间点各组生长因子表达量的变化,结果显示:10d、20d时各组新型羊膜粉中HGF、bFGF、EGF的表达均不低于新鲜羊膜组,且HGF、NGF R、bFGF、EGF在室温组的表达均不低于4℃组和-20℃组;30d时除HGF、bFGF外其余因子在各组的表达较新鲜羊膜组均下降,室温组中HGF、bFGF、EGF的表达均不低于4℃组和-20℃组,推测新型羊膜粉性质稳定可室温保存。体外细胞实验结果:培养72h后显微镜下观察到新型羊膜粉浓度为65mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml 的 AM-FS 胶泥未见细胞生长;从1mg/ml浓度组观察到角膜上皮细胞的生长,1mg/ml到0.5mg/ml浓度组角膜上皮细胞增长最显著。CCK-8检测结果:吸光度(A)值随新型羊膜粉浓度降低而升高,新型羊膜粉浓度在0.25mg/ml处达到最高,但结果与0.5mg/ml组差异无统计学意义(P>0.05),筛选新型羊膜粉浓度为0.25mg/ml的AM-FS胶泥进行动物实验。动物实验结果:AM-FS胶泥组在前2周降低角膜混浊度效果不明显(与实验对照组相比P>0.05),其降低角膜混浊度的作用在后2周才出现(与实验对照组相比P<0.05),第28d AM-FS胶泥组角膜混浊度与新鲜羊膜移植组差异无统计学意义(P<0.05),FS组在各时间点减少碱烧伤后角膜混浊度的效果不显著(与实验对照组相比P>0.05);各组兔碱烧伤后角膜新生血管面积均随时间而增加,但AM-FS胶泥组、新鲜羊膜移植组、FS组角膜新生血管面积在各时点均小于实验对照组(P<0.05),虽然新鲜羊膜移植组角膜新生血管面积在第7d、21d、28d均小于AM-FS胶泥组(P<0.05),但两组间新生血管面积各时间点的差值均较小(分别为0.34、0.38、0.88)。HE染色结果:AM-FS组和新鲜羊膜移植组的角膜结构完整,上皮排列趋于正常组织,角膜愈合优于FS组和实验对照组。免疫组化结果:VEGF在新鲜羊膜移植组的阳性表达较其余三组弱,AM-FS组和新鲜羊膜移植组中mcp-1的阳性表达程度相似。[结 论]37℃恒温风干新鲜羊膜并经液氮预冷后研磨制备的新型羊膜粉中活性细胞因子表达含量高,性质稳定可室温保存,其与纤维蛋白胶融合制备的AM-FS胶泥在兔眼表碱烧伤治疗中具有促进角膜上皮修复、抑制炎症及角膜新生血管生成的作用,并且使用便捷,为新型羊膜制品的研发提供新思路。