斑马鱼fem-1基因家族成员fem-1c的克隆与表达分析

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fem-1(feminization-1)基因最早发现于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans),在线虫性别决定通路中发挥重要作用。突变线虫fem-1基因将导致线虫向雌性化发育。在脊椎动物中存在fem-1a、fem-1b和fem-1c三个保守成员。  银鲫(Carassius auratus gibelio)可以采用雌核生殖或两性生殖的方式繁衍后代。在前期研究中,我们进行了银鲫下丘脑和垂体的转录组测序。在拼接结果中发现5条序列(暂命名为transcript1~5)具有基因重组特征,并且与fem-1基因家族成员有较高的相似性。传统的观念认为,行单性生殖的物种缺乏有性生殖的重组。为了验证转录组序列的正确与否,我们首先通过设计特异引物,采用PCR方法在异育银鲫“中科3号”基因组中克隆得到了transcript1~4四条序列,初步证实fem-1基因家族成员在银鲫中存在基因重组现象。接着利用银鲫全雄突变D系BAC文库,筛查到银鲫fem-1a和fem-1c基因的BAC克隆,并测序获得全长序列。fem-1a基因的BAC克隆插入片段全长143.074kb,生物信息学软件预测该克隆包含11个基因,同线性关系分析显示,脊椎动物fem-1a及其邻近基因不具有保守的同线性关系;fem-1c基因的BAC克隆的插入片段全长114.181kb,包含10个基因,脊椎动物中fem-1c与tmed7、trim36等邻近的4~5个基因具有保守的同线性关系。  利用半定量RT-PCR分别检测fem-1a、fem-1c及其可能的重组基因在银鲫、斑马鱼雌雄性腺中的表达差异情况,结果表明斑马鱼fem-1c特异表达于卵巢组织。  采用RACE-PCR方法从斑马鱼卵巢组织cDNA中克隆了fem-1c的cDNA全长序列,其大小为2701bp,编码618个氨基酸。生物信息学分析显示,斑马鱼FEM-1C蛋白包含9个ANK结构域、2个TPR结构域和2个低复杂性区域,与其他脊椎动物的FEM-1C蛋白序列保守性较高。半定量RT-PCR实验结果显示斑马鱼fem-1c在受精后17天开始表达,并特异地表达于成体卵巢组织中。RNA原位杂交结果显示,fem-1c基因mRNA定位于卵巢组织的Ⅰ期和Ⅱ期卵母细胞胞质中。fem-1c的时空表达特征暗示其在斑马鱼卵巢分化中具有重要作用。
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