【摘 要】
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目的:通过构建邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（Diethylhexyl phthalate,DEHP）青春前期暴露的动物模型和DEHP体内主要活性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己酯（Mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP）暴露的睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞模型,同时结合转录组测序和生物信息学分析,明确DEHP暴露导致未成熟睾丸发育损伤的作用及分子机制。方法:第一部分
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目的:通过构建邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（Diethylhexyl phthalate,DEHP）青春前期暴露的动物模型和DEHP体内主要活性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己酯（Mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP）暴露的睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞模型,同时结合转录组测序和生物信息学分析,明确DEHP暴露导致未成熟睾丸发育损伤的作用及分子机制。方法:第一部分:出生后的22天的C57/BL6J雄鼠随机分为4组:玉米油对照组和100、250、500 mg/Kg·天DEHP暴露组,连续灌胃14天,1次/天,构建青春前期DEHP暴露的动物模型:（1）计算睾丸脏器系数,H＆E染色观察睾丸组织形态学改变,明确DEHP暴露与未成熟睾丸发育损伤之间的病因学关联;（2）提取睾丸组织的总RNA以进行转录组测序,探索DEHP暴露致未成熟睾丸发育损伤的分子机制。第二部分:采用小鼠睾丸间质细胞系TM3（Leydig细胞）和支持细胞系TM4（Sertoli细胞）进行体外培养,并给予不同浓度的MEHP暴露:（1）检测细胞活力和存活/死亡水平,明确MEHP对睾丸体细胞的毒性作用;（2）通过对睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞进行转录组测序和生信分析,筛选出MEHP暴露致睾丸体细胞损伤相关的信号通路;（3）通过透射电镜观察Leydig细胞和Sertoli细胞的线粒体形态,同时检测细胞内亚铁离子(Ferrous iron,Fe2+)、脂质过氧化代谢产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）的水平以及铁死亡相关分子m RNA及蛋白水平表达情况,在MEHP暴露的同时给予铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1,检测细胞铁死亡水平,明确铁死亡在MEHP暴露所致睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞损伤中的作用;（4）检测HIF-1通路重要分子的m RNA及蛋白水平表达情况,并采用细胞免疫荧光及染色质免疫共沉淀的方法,明确HIF-1α作为转录因子,对细胞铁死亡重要分子HO-1的调控作用;（5）采用CRISPR/Cas9技术敲除睾丸间质细胞和支持细胞中的Hif-1α,并检测细胞铁死亡发生情况,明确HIF-1α在MEHP暴露致睾丸体细胞铁死亡的调控作用。结果:第一部分:青春前期DEHP暴露导致小鼠睾丸呈现发育损伤,包括睾丸脏器系数降低和曲细精管结构异常。转录组测序和生信分析结果发现DEHP暴露可引起睾丸组织中铁死亡通路和HIF-1通路活性升高。同时,睾丸组织Fe2+和MDA水平升高,铁死亡相关蛋白表达出现明显变化,提示睾丸组织铁死亡增加。睾丸组织的免疫荧光染色亦显示HIF-1α在曲细精管及间质细胞中表达增高。第二部分:MEHP暴露导致睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞活力下降和死亡增多。转录组测序结果发现,两种细胞中铁死亡通路、HIF-1通路及与铁死亡密切相关的谷胱甘肽通路被激活,DNA复制受到抑制。我们通过一系列分子生物学实验进行验证并得到以下结果:（1）MEHP暴露导致睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞的线粒体外膜密度增高、ROS水平升高、Fe2+以及MDA水平增加,诱发细胞铁死亡;（2）铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1可逆转MEHP所致的睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞的铁死亡;（3）MEHP暴露激活HIF-1通路,导致HIF-1α及HIF-1β表达增高及核易位,促进HIF-1与HO-1的编码基因Hmox1的启动子区结合,调控Hmox1的转录;（4）Hif-1α基因敲除可逆转MEHP所致睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞的铁死亡。结论:青春前期DEHP暴露可引起小鼠未成熟睾丸发育损伤。HIF-1α/HO-1信号通路介导的细胞铁死亡参与了MEHP暴露所致的睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞损伤。
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