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目的:多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）以慢性无排卵、胰岛素抵抗、高雄激素血症等为主要特征。其病因目前尚未明确,现在已知的致病因素包括遗传因素、环境因素、生活习惯因素等。在卵泡发育的早期,PCOS患者卵巢颗粒细胞过度增殖,而凋亡率较低,导致了大量窦前卵泡同时被募集而开始发育。且PCOS患者窦卵泡生长迟滞,增殖期更长,闭锁延迟,导致多数卵泡停滞在一定生长阶段并累积。颗粒细胞的过度增殖和凋亡减少会在卵泡发育早期导致颗粒细胞功能障碍,进而参与了PCOS的发生发展。长链非编码RNA（lnc RNAs）是指转录本长度在200-100000核苷酸之间,且不具备蛋白翻译能力的RNA。已有研究报道,多种lnc RNA可通过影响染色质重构,转录控制,转录后加工等等方式在PCOS中发挥作用。lnc-FRMD6-1:1属于lnc RNA的一种,截止目前,lnc-FRMD6-1:1的功能并无报道,其在PCOS中的作用也尚未清晰,课题组之前通过对PCOS患者以及正常对照卵泡液中的检测,发现在PCOS患者lnc-FRMD6-1:1的表达高于正常对照组。因此我们设计了本次实验,以确认lnc-FRMD6-1:1在PCOS中的作用以及其作用方式。正常情况下,卵巢的周期变化受促性腺激素和卵巢内生长因子的调节。胰岛素样生长因子-1（IGF-1 insulin-like growth factor 1）,在PCOS中过度激活,进而作用于IGF-1R以及胰岛素受体,引起一系列反应。而IGF-1R在其中的作用少有关注。miR-330-3p属于miRNA的一种,miRNA在细胞核内由RNA聚合酶完成转录,之后被加工成为具有茎环结构的miRNA前体之后转运到细胞质内,并剪切成为成熟miRNA,参与许多生物学功能。我们在此次实验中,验证了lnc-FRMD6-1:1通过miR-330-3p以及IGF-1R在PCOS中发挥的作用。研究方法:1、通过对已发表文章中报道的测序结果的汇总以及对在线数据库的生物信息学分析,筛选出PCOS患者与正常对照之间可能的差异基因,并预测其调控关系以及可能的结合位点。收集PCOS患者与正常对照组的卵巢颗粒细胞样本,通过q PCR验证lnc-FRMD6-1:1,miR-330-3p以及IGF-1R在多囊卵巢综合征卵巢颗粒细胞中的表达情况。并通过DHEA+HFD构建PCOS小鼠动物模型,检测PCOS小鼠以及正常对照小鼠卵巢内lnc-FRMD6-1:1,miR-330-3p以及IGF-1R的表达情况。2、使用RNA22工具预测miR-330-3p与lnc-FRMD6-1:1以及IGF-1R的3’UTR区域的结合位点。在人卵巢颗粒瘤细胞系KGN以及COV434中转染lnc-FRMD6-1:1si RNA以及lnc-FRMD6-1:1过表达质粒,构建lnc-FRMD6-1:1敲减以及过表达细胞模型,通过q PCR验证模型建立。并同样使用q PCR检测其下游miR-330-3p表达改变。使用miR-330-3p mimics以及inhibitor转染KGN以及COV434细胞,构建miR-330-3p敲减以及过表达细胞模型,通过q PCR验证模型建立。并同样使用q PCR检测lnc-FRMD6-1:1以及IGF-1R表达改变。使用WB在蛋白水平上检测IGF-1R表达情况。使用免疫荧光进一步验证IGF-1R在细胞内的表达改变。使用lnc-FRMD6-1:1和IGF-1R突变型以及野生型质粒分别与miR-330-3p mimics以及mimics NC共转染工具细胞。验证它们之间的结合位点。3、构建lnc-FRMD6-1:1敲减以及过表达细胞模型,以及miR-330-3p敲减细胞模型,使用CCK-8实验检测其对细胞增殖的影响。使用MTT实验检测其对细胞增殖的影响。使用流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响,使用WB检测凋亡相关蛋白检测其对细胞凋亡的影响。分别使用lnc-FRMD6-1:1 si RNA;lnc-FRMD6-1:1si RNA+miR-330-3p inhibitor;lnc-FRMD6-1:1 si RNA NC+miR-330-3p inhibitor NC转染KGN以及COV434细胞。以上述实验检测其对细胞增殖,凋亡的影响。证明miR-330-3p inhibitor对lnc-FRMD6-1:1敲减所带来的细胞行为改变的部分回复。最后构建PCOS小鼠动物模型,随机分为两组,一组经由尾静脉注射miR-330-3p agomir,一组注射miR-330-3p agomir NC,连续注射三天,注射结束后三天采集空腹血糖,记录体重并观察卵巢大小,HE染色观察PCOS回复情况,q PCR检测对agomir对lnc-FRMD6-1:1和IGF-1R的作用。结果:1、在PCOS患者卵巢颗粒细胞中,相比于对照组,lnc-FRMD6-1:1以及IGF-1R呈现高表达,而miR-330-3p呈现低表达。PCOS组小鼠动情周期紊乱,无规律排卵,在PCOS组小鼠卵巢中,相比于对照组lnc-FRMD6-1:1以及IGF-1R呈现高表达,而miR-330-3p呈现低表达。2、预测结果显示miR-330-3p与lnc-FRMD6-1:1以及IGF-1R 3’UTR区域之间存在可能的结合位点。q PCR显示敲减lnc-FRMD6-1:1的细胞模型中miR-330-3p显著上调,而过表达lnc-FRMD6-1:1的细胞模型中miR-330-3p表达下调。转染miR-330-3p mimics后,lnc-FRMD6-1:1以及IGF-1R在RNA水平表达下降,WB和免疫荧光实验证明转染miR-330-3p mimics后IGF-1R在蛋白水平表达下降。转染miR-330-3p inhibitor后lnc-FRMD6-1:1以及IGF-1R在RNA水平表达上升,WB和免疫荧光实验证明转染miR-330-3p inhibitor后IGF-1R在蛋白水平表达上调。双荧光素酶报告基因的结果显示:野生型lnc-FRMD6-1:1+miR-330-3p mimics组以及野生型IGF-1R+miR-330-3p mimics组的相对荧光素酶活性均低于另外三组,验证了miR-330-3p与lnc RNA lnc-FRMD6-1:1和IGF-1R之间的预测区域可能存在结合位点。3、CCK-8实验,MTT实验,Annexin V-FITC凋亡检测以及WB检测凋亡相关蛋白显示:lnc-FRMD6-1:1敲减后细胞增殖减少,凋亡上升。过表达lnc-FRMD6-1:1后细胞增殖上升,凋亡减少。敲减miR-330-3p后细胞增殖上升,凋亡减少。miR-330-3p inhibitor部分回复了lnc-FRMD6-1:1敲减所带来的细胞增殖和凋亡水平的改变。尾静脉注射miR-330-3p agomir后,PCOS小鼠的空腹血糖略微下降,miR-330-3p agomir组小鼠较agomir NC组卵巢较小,外表较为圆润,凸起部分减少。HE染色显示agomir NC组卵巢卵泡数量增多,部分呈现多囊样改变,无明显黄体,卵泡腔巨大。而miR-330-3p agomir组小鼠卵巢内各阶段卵泡较少,可见明显黄体,仍有部分卵泡呈现多囊样改变。说明其PCOS症状有所缓解。结论:在PCOS卵巢中相比于对照组,lnc-FRMD6-1:1以及IGF-1R呈现高表达,而miR-330-3p呈现低表达。高表达的lnc-FRMD6-1:1通过竞争性结合miR-330-3p调节IGF-1R的表达,进而通过促进颗粒细胞增殖以及抑制颗粒细胞凋亡,对PCOS的进展产生影响。