选题背景：　　 隐球菌是一种条件性致病真菌，其中仅新生隐球菌及其变种具有致病性。相关研究显示，隐球菌侵入人体的可能途径为通过肺吸入，穿越肺血屏障后入血，播散至全身，甚至穿越血脑屏障而侵袭中枢神经系统。在隐球菌病的研究中亟待解决的问题是对隐球菌的致病机制和并发症机制还缺乏足够的了解。　　 颅内压增高是隐球菌性脑膜脑炎最危险的临床症状之一，主要与炎症引起的脑水肿有关。目前对本病脑水肿发生机制的研究尚属空白，临床中缺乏治疗手段，因此，隐球菌性脑膜脑炎中脑水肿形成机制的研究显得尤为重要。　　 目前对脑水肿形成机制的研究尚未完全明了，有研究发现AQP4蛋白与脑水肿密切相关。AQPs是一类处于持续开放状态的膜通道蛋白，其中AQP4 选择性的高表达于中枢神经系统可能构成血脑屏障的第二道隔膜，起调节水运输的作用；另外也有文献报导AQP4 可能是一种渗透压感受器或受体，对渗透压的变化具有渗透调节作用。在脑组织中水转运和平衡的维持与脑脊液密切相关。而VEGFR1及VEGFR2 参与血管内皮细胞的分化，对于维持血脑屏障的完整性及高度选择通透性具有重要的作用。由此我们推测VEGFR和AQP4 可能新生隐球菌感染后的嗜中枢性及脑水肿产生机制密切相关。　　 本课题选取了有代表性的A 血清型新生隐球菌H99 MATα型菌株作为研究对象。　　 研究目的：　　 1.构建体外新型血脑屏障模型，基因芯片技术观察隐球菌作用后与VEGF 受体及AQP4通路相关基因表达变化。　　 2.构建新生隐球菌中枢神经系统感染的动物模型，干湿重法观察脑组织含水量变化。　　 3.观察VEGF 受体表达与隐球菌性脑膜炎所致脑水肿的关系。　　 4.观察AQP4表达与隐球菌性脑膜炎所致脑水肿的关系。　　 研究方法：　　 1.构建体外新型血脑屏障模型，基因芯片技术观察隐球菌作用后与VEGF 受体及AQP4通路相关基因表达变化。　　 使用Transwell 系统构建体外完整血脑屏障模型。　　 运用基因芯片技术观察血脑屏障模型与隐球菌作用前后，VEGF 受体及AQP4通路相关基因表达变化。　　 2.构建新生隐球菌中枢神经系统感染的动物模型，干湿重法观察脑组织含水量变化。　　 采用小鼠尾静脉、大鼠脑室注射接种菌悬液方法构建新生隐球菌中枢神经系统感染动物模型。　　 采用干湿重法观察小鼠及大鼠感染隐球菌后脑组织含水量的变化。　　 3.观察VEGF 受体表达与隐球菌性脑膜炎所致脑水肿的关系。　　 采用RT-PCR 方法观察感染隐球菌小鼠脑组织中VEGFR1及VEGFR2基因表达情况。　　 采用western blotting 技术观察感染隐球菌小鼠脑组织中VEGFR1及VEGFR2蛋白表达情况。　　 4.观察AQP4表达与隐球菌性脑膜炎所致脑水肿的关系。　　 采用western blotting 技术观察感染隐球菌小鼠脑组织中AQP4蛋白表达情况。　　 采用RNA 干扰的方法将大鼠脑内AQP4表达进行下调，在下调后第7天（此时相为下调的峰值），右脑室接种隐球菌菌悬液，建立AQP4 RNAi大鼠隐球菌性脑膜脑炎模型，分别用western blotting和干-湿重法对RNA 干扰后大鼠的脑内AQP4表达和脑组织含水量的动态变化进行研究和分析。　　 结果：　　 1.构建体外新型血脑屏障模型，基因芯片技术观察隐球菌作用后与VEGF 受体及AQP4通路相关基因表达变化。　　 基因芯片结果显示Signaling events mediated by VEGFR1and VEGFR2通路中发现5个表达下调的差异基因，为ROCK1、IQGAP1、KRIT1、HSP90AA1、PDPK1。　　 VEGFR1specific signals通路中KRIT1、HSP90AA1、PDPK1三个差异基因表达下调。　　 AQP4 涉及的Vasopressin-regulated water reabsorption通路中，我们发现DYNC1H1基因表达下调，其与AQP4 共同参与血脑屏障对于脑组织中相关水重吸收变化的调节。　　 2.构建新生隐球菌中枢神经系统感染的动物模型，干湿重法观察脑组织含水量变化。　　 采用健康C57BL/6小鼠尾静脉注射接种隐球菌菌悬液的方法，建立小鼠隐球菌性脑膜脑炎模型，实验组隐球菌性脑膜脑炎小鼠模型脑组织含水量于接种隐球菌菌悬液后6h 开始升高，24h 达高峰，小鼠脑组织含水量与对照组比较差异显著。　　 3.观察VEGF 受体表达与隐球菌性脑膜炎所致脑水肿的关系。　　 隐球菌性脑膜炎脑组织中VEGFR1及VEGFR2中mRNA表达与对照组相比随感染时间的延长表达逐渐下降，而其蛋白表达水平亦明显下降。　　 4.观察AQP4表达与隐球菌性脑膜炎所致脑水肿的关系。　　 实验组小鼠脑组织中AQP4蛋白表达从接种菌悬液后24h 开始升高，48h 达高峰，在24h和48h与对照组比较差异显著。RNAi组大鼠AQP4表达在干扰后第二天开始呈进行性减少，至术后第7天减少到峰值，术后第14天和第7天无明显差别，分别减少59.15％和58.87％，经方差分析检验，与对照组差异显著，有统计学意义。右脑室接种隐球菌菌悬液后，RNAi 隐球菌感染组和隐球菌感染组脑组织含水量6h后开始明显升高，12h 达高峰，其中隐球菌感染组为（83.61±0.44）％，RNAi 隐球菌感染组为（85.67±0.59）％，假手术组各时间点均在78.52％左右。在6h、12h、24h和48h 脑组织含水量各组比较差异显著，RNAi 隐球菌感染组的脑水肿程度高于隐球菌感染组，经方差分析检验，显著差异，有统计学意义。　　 结论：　　 小鼠感染隐球菌后脑组织含水量从接种隐球菌菌悬液后6h 开始升高，24h 达峰值，隐球菌经过血液循环作用于血脑屏障，引起VEGFR1和VEGFR2基因及蛋白表达下降，影响与血脑屏障中信号传导通路相关下游基因表达的下调，使血脑屏障通透性相关信号传导通路改变，进而破坏脑血管内皮细胞的完整性及血脑屏障的高度选择通透性，增加了血脑屏障通透性，使隐球菌易于通过血脑屏障而感染中枢神经系统，引起致命性的脑水肿。并且发现新生隐球菌中枢神经系统感染动物模型在6h、12h、24h、48h、72h 各时相点AQP4蛋白在脑组织中的表达增加；进一步应用RNA 干扰技术发现AQP4对隐球菌所致脑膜炎起负向调控作用，既隐球菌感染中枢神经系统后AQP4蛋白表达上调，引起水通道转运下游通路中的DYNC1H1基因表达下调，减轻脑水肿的发生。