目的：肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化过程中成纤维细胞的主要来源，肝星状细胞被激活而转化为肌成纤维样细胞并分泌细胞外基质是肝纤维化发生、发展的重要环节；另外，活化的肝星状细胞可以促进肝癌细胞生长、迁移和活力，而肝癌细胞反过来也可以促进肝星状细胞的增殖、迁移、分泌纤维化因子及增强促血管生成的活性，二者相互作用的恶性循环，促进了肝癌的发展。CCN1即富半胱氨酸61(cysteinerich61, Cyr61)，是CCN家族成员之一，是一种重要的细胞外基质调节因子，通过作用于成纤维细胞，在皮肤创伤-愈合过程中起重要作用。肝脏疾病中，CCN1促进了非酒精脂肪性肝炎中巨噬细胞的浸润和肝癌细胞的增殖与迁移，在癌周肝硬化和良性肝硬化组织中CCN1呈高表达，而肝星状细胞膜上高表达CCN1的受体—整合素，提示CCN1可以作用于肝星状细胞，但作用机制尚不清楚。本研究通过建立肝纤维化动物模型，并结合细胞共培养和裸鼠皮下瘤等实验，证明如下假设：CCN1在肝纤维化-肝硬化发展进程中呈动态表达，其表达水平与肝纤维化的发展进程相关；CCN1参与促进肝星状细胞的活化；肝纤维化-肝硬化-肝癌进程中高表达的CCN1增强了肝星状细胞的促癌作用，最终揭示CCN1在肝硬化-肝癌发生进程中的作用和机制。方法：1. CCN1在肝纤维化-肝硬化-肝癌疾病进程中表达的研究1.1检测分析人肝硬化病例组织标本中CCN1蛋白的表达及定位。1.1.1应用免疫组化染色法检测32例良性肝硬化组织、30例癌周肝硬化组织和5例正常成人肝脏组织CCN1蛋白的表达情况。1.1.2应用免疫荧光染色法(CCN1和α-SMA双标)检测肝硬化病例组织标本中CCN1蛋白的表达定位情况。1.2肝纤维化动物模型中动态观察CCN1蛋白在肝纤维化发生、发展进程的表达规律及定位情况。1.2.1四氯化碳(CCL4)诱导法制作肝纤维化小鼠模型，在制作过程中应用HE染色、SIRIUS RED染色、免疫组织化学染色和Western-blot等方法，动态观察肝脏病变程度、胶原纤维生成情况及肝组织中CCN1蛋白的表达情况。1.2.2肝纤维化小鼠模型成型后停止注射四氯化碳，应用HE染色、SIRIUS RED染色、免疫组织化学染色和Western-blot等方法，观察肝纤维化病情变化与CCN1蛋白表达变化情况。1.2.3免疫荧光染色法(CCN1和α-SMA双标)，分析CCN1蛋白的表达定位情况。1.3Western-blot检测人和大鼠肝星状细胞株中CCN1蛋白的表达情况。2. CCN1在体外促进肝星状细胞活化作用的研究2.1以HEK293细胞扩增重组腺病毒AdCCN1和AdRFP，体外检测病毒感染滴度。2.2分别用AdCCN1或AdRFP感染肝星状细胞，荧光显微镜观察细胞荧光表达情况，Western-blot检测肝星状细胞中CCN1表达情况，应用MTT方法检测肝星状细胞的增殖能力，Western-blot方法检测肝星状细胞中α-SMA蛋白和Ⅰ型胶原表达情况。2.3CCN1通过整合素αv调控肝星状细胞活化的研究。分别用AdCCN1或AdRFP感染肝星状细胞，12小时后加入整合素αv的抗体，应用MTT方法检测肝星状细胞的增殖能力，Western-blot检测肝星状细胞中CCN1、α-SMA蛋白和Ⅰ型胶原表达情况。3. CCN1增强肝星状细胞促癌作用的研究3.1CCN1增强肝星状细胞促进肝癌细胞增殖作用的研究。3.1.1分别用AdCCN1或AdRFP感染肝星状细胞Lx-2，收集其条件培养液，并用以处理肝癌细胞HepG2，并应用MTT方法检测HepG2细胞的增殖能力。3.1.2分别用AdCCN1或AdRFP感染肝星状细胞Lx-2，并与HepG2细胞共培养，5天后将HepG2细胞进行结晶紫染色，观察其克隆形成的情况。3.1.3分别用AdCCN1或AdRFP感染肝星状细胞Lx-2，收集其条件培养液，并用以处理肝癌细胞HepG2，Western-blot检测HepG2细胞中肿瘤相关信号分子的表达情况。3.2CCN1增强肝星状细胞促进肝癌细胞迁移和侵袭作用的研究。3.2.1分别用AdCCN1或AdRFP肝星状细胞Lx-2，收集其条件培养液，并用以处理肝癌细胞HepG2，应用划痕-愈合实验、Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验检测HepG2细胞迁移和侵袭能力。3.2.2分别用AdCCN1或AdRFP感染肝星状细胞Lx-2，收集其条件培养液，并用以处理肝癌细胞HepG2，Western-blot检测HepG2细胞中侵袭相关信号分子的表达情况。3.3体内研究CCN1增强肝星状细胞的促癌作用。3.3.1分别用AdCCN1或AdRFP感染肝星状细胞LX-2，得到LX-2-CCN1和LX-2-RFP细胞，分别将HepG2、 LX-2、 HepG2+LX-2、 HepG2+LX-2-RFP和HepG2+LX-2-CCN1五组细胞注入裸鼠皮下。3.3.2动态检测各组皮下瘤生长情况，26天后处死裸鼠收集皮下瘤，制作石蜡切片，并提取皮下瘤组织总蛋白。3.3.3皮下瘤石蜡切片进行HE染色，观察组织形态。3.3.4皮下瘤石蜡切片进行SIRIUS RED染色，观察瘤组织中胶原纤维生成的情况。3.3.5皮下瘤石蜡切片进行免疫组化染色，检测瘤组织中Ki67表达情况。3.3.6皮下瘤石蜡切片进行免疫组化和免疫荧光染色—CD31，检测瘤组织中微血管的生成情况，Western-blot检测皮下瘤组织中VEGF蛋白表达情况。结果：1.临床病例检测发现，肝硬化和肝癌癌周肝硬化组织中CCN1呈高表达，主要表达于肝实质细胞中，间质散在表达，正常成人肝脏组织不表达CCN1，病例组织中活化的肝星状细胞中未检测到CCN1表达。2.肝纤维化动物模型中发现，肝纤维化发展进程中CCN1表达增高，并随病情发展呈动态变化：CCL4持续作用——病情持续加重——CCN1逐渐升高；停止CCL4作用—病情持续减轻—CCN1持续降低，而肝纤维化小鼠肝脏中活化的肝星状细胞中检测到CCN1表达。3.体外检测发现，人肝星状细胞株LX-2中不表达CCN1蛋白，而大鼠肝星状细胞株T6中CCN1呈弱表达，与临床标本和动物模型的研究结果一致。4. CCN1促进了肝星状细胞LX-2和T6的增殖能力，并且上调了两种细胞Collagen Ⅰ及α-SMA蛋白的表达。5.阻断LX-2细胞膜上的整合素αv，抑制了CCN1促进LX-2细胞增殖和表达Collagen Ⅰ及α-SMA蛋白的能力。6.体外研究结果显示，CCN1作用于肝星状细胞LX-2，增强了其促进肝癌细胞HepG2增殖的作用，并使HepG2细胞中β-catenin信号通路的活性增强，并使下游基因cycline D1、c-myc、survivin及CD34等癌基因或肿瘤相关因子表达增高。7.体外研究结果显示，CCN1作用于肝星状细胞LX-2，增强了其促进肝癌细胞HepG2迁移及侵袭的作用，并使HepG2细胞中侵袭相关信号通路活性蛋白p-ERK1/2和下游效应蛋白MMP-9表达增高，同时细胞粘附相关蛋白E-cadherin的表达降低。8.裸鼠皮下瘤实验结果显示， LX-2细胞单独注入裸鼠皮下后不能形成皮下瘤，而其余四组细胞注入裸鼠皮下后均形成皮下瘤，其中HepG2+LX-2-CCN1组的皮下瘤生长最快。9.和对照组相比，HepG2+LX-2-CCN1组的皮下瘤组织结构较复杂，瘤细胞排列较混乱，纤维结缔组织大量增生，细胞呈多形性，组织间有炎细胞浸润。10.和对照组相比，HepG2+LX-2-CCN1组的皮下瘤组织中胶原纤维生成的量较多，同时其Ki67阳性细胞数量较多及染色程度较强。11.和对照组相比，HepG2+LX-2-CCN1组的皮下瘤组织中微血管的数量最多；Western-blot结果显示，HepG2+LX-2-CCN1组的皮下瘤组织中VEGF蛋白表达量最高。结论：1．临床病例检测发现，良性肝硬化和肝癌癌周肝硬化组织中，CCN1在肝实质细胞中高表达；而在鼠肝纤维化模型，CCN1随肝纤维化发展过程呈动态变化，提示CCN1可能在肝纤维化-肝硬化发展过程中发挥一定作用。人和鼠肝星状细胞中CCN1的表达情况表明，CCN1在人和鼠肝纤维化疾病病理过程中的作用机制可能有所不同。2．过表达CCN1促进了肝星状细胞株LX-2和T6的增殖，并且上调了两种细胞中collagen Ⅰ及α-SMA蛋白的表达，提示肝纤维化-肝癌进程中，高表达的CCN1可以参与肝星状细胞的活化；阻断LX-2细胞膜上的整合素αv可以抑制CCN1促进肝星状细胞活化的作用，表明CCN1通过与受体整合素αv结合而促进肝星状细胞活化。3．CCN1作用于肝星状细胞LX-2，增强了LX-2细胞促进肝癌细胞HepG2增殖、迁移及侵袭的能力，同时提高了其促进HepG2细胞在裸鼠体内成瘤的能力。其机制是：CCN1作用于LX-2细胞增强了其促进肝癌细胞活性增高的作用，同时CCN1作用于LX-2细胞使其生成的肿瘤微环境更利于肿瘤生长。本研究证明，在“肝纤维化-肝硬化-肝癌”进程中，高表达的CCN1增强了肝星状细胞的促癌作用。