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百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus),是侵染百合的主要病毒之一。LMoV侵染百合后引起斑驳或条纹症状,严重时导致百合种球产量和质量降低。目前,关于LMoV的致病机理尚不清楚,其编码蛋白功能的研究也尚属空白,严重阻碍了百合病毒病的防治工作。本文建立了检测LMoV的血清学方法,并初步证明了LMoV对百合叶绿体的影响,以期为阐明LMoV的致病机理奠定基础。根据GenBank中LMoV基因序列(HM222521.1),设计特异性引物,利用RT-PCR技术,以提取的百合叶片总RNA为模板,扩增到LMoV CP基因,获得了约822 bβ的目的片段。将目的片段连接到克隆载体pMDTM18-T中,构建重组质粒pMDTM18-CP,将其转化至大肠杆菌DH5α中,提取重组质粒进行PCR和双酶切验证正确后测序,结果表明成功构建了重组质粒pMDTM18-CP.以pMDTM18-CP为模板,PCR扩增得到LMoV CP基因。利用pET-28a(+)作为表达载体,成功构建了重组表达质粒pET28a-CP,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经过SDS-PAGE分析,结果发现pET28a-CP成功在大肠杆菌中表达出相对分子质量约为34 kDa的带有His标签的融合蛋白。对诱导表达的温度和时间进行优化,确定了融合蛋白的最佳表达条件是30℃条件下诱导4 h。利用Ni-IDA-Sefinose在变性条件下对表达产物进行纯化,得到表达量较高的单一目的蛋白条带。以表达的融合蛋白为抗原制备LMoV的抗血清,利用间接ELISA和Western blot分别对制备的抗血清进行了检测,其效价为1：51200,且特异性较高。随机选取7个百合样品同时进行间接ELISA和RT-PCR检测,两次检测结果一致,由此证明,本研究中制备的LMoV CP抗血清可用于百合样品的检测。电镜观察发现：感病百合叶绿体膨胀变形,基质片层散乱,叶绿体内淀粉粒肿大,从而证明LMo V侵染破坏叶绿体结构。免疫金标记电镜观察显示,与LMoV CP抗原特异性结合的胶体金颗粒主要定位于类囊体膜上。SDS-PAGE和Western blot证明LMoV侵染百合后,CP存在于叶绿体内,这与免疫金标记的观察结果一致。在离体条件下进行LMoV CP的叶绿体跨膜运输实验,研究孵育时间和CP蛋白浓度对LMoV CP在百合叶绿体中离体跨膜运输效率的影响。结果显示在离体条件下LMoV CP蛋白浓度为30μg/μL时,与叶绿体保温1 min即可进入叶绿体中。