背景和目的急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)目前已经成为重症监护室患者病死最主要的原因之一,其更严重的形式为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distresssyndrome,ARDS)。1967年由美国-欧洲共识会议首次定义急性呼吸窘迫综合征,尽管在美国每年大约有15万人被诊断为ARDS,在全球范围内,ARDS患者占了重症监护病房的10%,每年有超过300万的病例,ALI的死亡率仍高达30%-40%,ARDS死亡率仍保持在40%~50%,但目前临床上尚未找到确切疗效的治疗药物,也未建立一个标准的治疗方案。因其病情进展迅速,病死率高,缺乏有效的治疗手段,因此寻找ALI/ARDS的治疗药物和探讨其机制尤为重要。利多卡因作为临床上常用的局麻药,其抗炎作用已经得到广泛的认可,关于其抗炎机制的研究,发现利多卡因可通过三磷酸腺苷盐敏感钾离子通道,减弱细胞因子诱导的内皮和血管平滑肌细胞的损伤;阻断K离子和Na离子通道从而抑制NF-κB活化;通过抑制细胞内钙的增加及P38 MAPK的活化来减弱小胶质细胞外ATP引起的促炎细胞因子的产生或者通过下调TLR4(Toll like receptor4,TLR4)信号通路减轻炎症反应。在体实验与离体实验都证明利多卡因能够抑制炎症因子的表达,如白介素-1β(IL-1β),白介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-18(IL-18),高迁移率蛋白B1(High mobility group box1,HMGB1)等,减轻急性肺损伤,表现出肺保护效应。在动物模型上发现利多卡因不仅可以降低炎症因子的表达,还同时降低肺泡动脉血氧分压差,降低肺组织中性粒细胞聚集从而减轻肺损伤程度;在临床研究上,同样发现利多卡因可以降低中性粒细胞趋化和转移,降低T细胞增殖,减少炎症因子释放。P2X7受体是三磷酸腺苷(ATP)门控的离子通道受体,属于P2家族。P2X7受体作为离子通道受体,不仅可以通过较小的阳离子,如钠离子,钾离子和钙离子,也可以通过较大的阳离子,如N-甲基-D-葡萄糖胺和纳米级染料等参与炎症反应。众多研究表明,在组织或细胞受到损伤时,细胞外ATP浓度升高,激活P2X7受体,进而激活其下游通路NLRP3/Caspase-1,进一步诱导IL-1β的成熟和释放并且启动炎症级联反应。近年来,该通路研究较热门,并发现其在已知的一些炎症反应中起着至关重要的作用,如缺血再灌注损伤,心肌炎,急性肝损伤,急性肺损伤等,其中P2X7受体抑制剂BBG(brilliant blue G)通过对P2X7受体的非竞争性抑制作用下调其下游通路NLRP3/Caspase-1发挥抗炎作用的研究也进一步证明P2X7受体在炎症链中的重要作用。根据之前的研究可以发现利多卡因抗炎作用相关的机制众多,利多卡因与P2X7受体两者均参与多种炎症反应过程,且与离子通道相关,但关于利多卡因对P2X7R/NLRP3/Caspase-1通路的作用以及是否通过该通路抑制炎症反应的研究甚少,那么我们猜想利多卡因可否通过抑制ATP门控的离子通道P2X7受体的表达,下调其下游通路NLRP3/Caspase-1从而减轻急性肺损伤程度。在之前的研究基础上,我们通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立ALI大鼠动物模型,从肺组织病理学表现,炎症因子表达水平,P2X7R/NLRP3/Caspase-1表达水平去探究利多卡因对ALI的保护效应和可能的机制,为ALI/ARDS的治疗切入点带来新的希望。方法选择体重180g~220g左右的成年SPF级雄性SD(Sprague Dawley,SD)大鼠40只,购自广东省实验动物中心,于广州市第一人民医院中心实验室动物房饲养,昼夜交替12h,自由摄食及饮水,适应1~2周后建立急性肺损伤模型。将40只雄性SD大鼠随机分成生理盐水对照组(NS组)、脂多糖组(LPS组)、5mg/kg利多卡因治疗组(5LD组)、10mg/kg利多卡因治疗组(10LD组)、20mg/kg利多卡因治疗组(20LD组)。对照组给予等量的生理盐水,其余四组通过腹腔注射5mg/kg LPS建立脓毒症急性肺损伤模型,并在LPS注射前10min、LPS注射后1h、3h给予相应剂量利多卡因或等剂量生理盐水处理。LPS给药24h后,2%戊巴比妥钠过量麻醉处死大鼠,留取肺组织标本,测定肺组织湿/干重比值(W/D比值),苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化,比色法检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)活力,实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR、QPCR)技术分别检测肺组织标本中P2X7R mRNA、NLRP3 mRNA的含量,免疫印迹法(Western blotting)检测肺组织标本中P2X7R、NLRP3、Casepase-1蛋白的含量,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测肺组织标本中IL-1β、HMGB1的含量。应用SigmaPlot 13.0软件进行统计分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)的Dunnet-t检验,检验水准α=0.05,以P<0.05认为差异有统计学意义,用Graphpad prism5软件进行作图。结果1、HE染色肺组织病理学观察:利多卡因减轻肺组织病理损伤程度肺组织HE染色后,在显微镜下观察,NS组肺组织结构完整,肺泡间隔无水肿扩张,无明显炎症渗出,肺泡腔清晰;LPS组与NS组比较,LPS组见肺组织结构明显受损,肺泡毛细血管扩张,肺泡腔有红细胞渗出,肺泡间隔水肿、大量炎症细胞浸润、出血;20LD组与LPS组比较,肺泡结构基本完整,肺泡间隔水肿、炎症细胞浸润、出血均较LPS组明显减轻;5LD组与10LD组肺组织损伤程度,肺泡间隔水肿、炎症细胞浸润、出血较LPS组均有减轻,但不如20LD组减轻明显。以上结果表明LPS可诱导肺组织病理损伤,而利多卡因可以呈剂量依赖性地改善LPS引起的肺组织病理损伤。2、利多卡因减轻肺水肿程度,降低W/D比值与NS组比较,LPS组的W/D值明显更高(P<0.001),肺水肿程度严重,5LD组与LPS组比较,W/D值下降,表明肺水肿程度有改善但差异无统计学意义(P>0.05),而10LD组与20LD组的W/D值明显低于LPS组(P<0.01),表明10LD组与20LD组肺水肿程度明显减轻。以上结果表明LPS引起肺组织水肿,肺组织湿干重比值增大,而利多卡因可以呈剂量依赖性地改善LPS引起的肺组织水肿程度,降低W/D值。3、利多卡因呈剂量依赖性地降低肺组织P2X7R蛋白表达水平LPS组与NS组比较,P2X7R蛋白表达明显增加(P<0.001),5LD组与LPS组比较,P2X7R蛋白表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05),10LD组与LPS组比较,P2X7R蛋白表达降低(P<0.05),20LD组与LPS组比较,P2X7R蛋白表达明显降低(P<0.001)。以上结果表明LPS上调P2X7R蛋白表达,5mg/kg利多卡因对P2X7R蛋白表达影响甚微,10mg/kg利多卡因与20mg/kg利多卡因可以降低P2X7R蛋白表达且呈剂量依赖性。4、利多卡因呈剂量依赖性地降低NLRP3蛋白表达水平LPS组与NS组比较,NLRP3蛋白表达明显增加(P<0.001),5LD组与LPS组比较,NLRP3蛋白表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05),10LD组与LPS组比较,NLRP3蛋白表达降低(P<0.01),20LD组与LPS组比较,NLRP3蛋白表达明显降低(P<0.001)。以上结果表明LPS上调NLRP3蛋白表达,5mg/kg利多卡因对NLRP3蛋白表达影响很小,10mg/kg利多卡因与20mg/kg利多卡因可以降低NLRP3蛋白表达量且呈剂量依赖性。5、利多卡因呈剂量依赖性地降低肺组织Caspase-1蛋白表达水平在对照组中Caspase-1有少量表达,LPS组与NS组比较,Caspase-1蛋白表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);5LD组与LPS组比较,Caspase-1蛋白表达量减少,但差异无统计学意义(P>0.05);10LD组与LPS组比较,Caspase-1蛋白表达量减少,且相对于5LD组减少程度更多,但差异无统计学意义(P>0.05);20LD组与LPS组比较,Caspase-1蛋白表达量明显减少(P<0.05)。以上结果表明LPS上调Caspase-1蛋白表达,5mg/kg利多卡因与10mg/kg利多卡因对caspase-1蛋白的表达影响小,20mg/kg利多卡因可以明显的降低caspase-1蛋白的表达量。6、利多卡因呈剂量依赖性地降低肺组织P2X7R mRNA含量、NLRP3 mRNA含量在NS组中P2X7R mRNA含量、NLRP3 mRNA含量有少量表达,LPS组与对照组比较,P2X7R mRNA含量、NLRP3 mRNA含量明显增加(P<0.05);5LD组与LPS组比较,P2X7R mRNA含量、NLRP3 mRNA含量表达减少,但差异无统计学意义(P>0.05);10LD组与LPS组比较,P2X7R mRNA含量明显减少(P<0.05),NLRP3 mRNA含量明显减少(P<0.01);20LD组与LPS组比较,P2X7R mRNA含量明显减少(P<0.05),NLRP3 mRNA含量明显减少(P<0.001)。以上结果表明LPS上调P2X7R mRNA、NLRP3 mRNA表达,5mg/kg利多卡因对P2X7R mRNA和NLRP3 mRNA含量的表达影响小,而10mg/kg和20mg/kg利多卡因可以明显降低P2X7R mRNA和NLRP3mRNA含量且呈剂量依赖性。7、利多卡因呈剂量依赖性地降低肺组织IL-1β、HMGB1表达水平与NS组比较,LPS组IL-1β、HMGB1水平明显增高(P<0.001);5LD组与LPS组比较,IL-1β、HMGB1表达水平均降低(P<0.05);10LD组与LPS组比较,IL-1β表达水平明显降低(P<0.001),HMGB1表达水平明显降低(P<0.01);20LD组与LPS组比较,IL-1β表达水平明显降低(P<0.001),HMGB1表达水平明显降低(P<0.01)。以上结果表明LPS诱导促炎因子IL-1β、HMGB1释放增加,而利多卡因可以呈剂量依赖性地降低IL-1β、HMGB1表达量。8、利多卡因减少肺组织中性粒细胞聚集,降低肺组织MPO含量与NS组比较,LPS组MPO活力水平明显增高(P<0.001);5LD组与LPS组比较,MPO活力水平降低(P<0.05);10LD组与LPS组比较,MPO活力水平明显降低(P<0.01);20LD组与LPS组对比,MPO活力水平明显降低(P<0.001)。以上结果表明LPS诱导肺组织中性粒细胞浸润增多,MPO活力水平增高,而利多卡因可以呈剂量依赖性的减少肺组织中性粒细胞浸润,降低MPO活力水平。结论利多卡因可以呈剂量依赖性地降低脂多糖诱导的炎症因子释放,改善大鼠急性肺损伤程度,其机制可能与抑制了P2X7R/NLRP3/Caspase-1轴从而减少炎症因子释放有关。