论文部分内容阅读
铅(Lead, Pb)是一种普遍存在的环境重金属污染物，有较强的神经毒性，并损伤认知功能，发育期的铅暴露可以诱发阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)样病变的形成。多酚类化合物白藜芦醇(Resveratrol, Res)对神经退行性疾病和急性损伤具有保护作用，Res激活产物沉默信息调节因子1(Silent InformationRegulator1, SIRT1)具有抗氧化作用，而氧化应激是AD产生的重要机制之一，SIRT1对于氧化应激的相关调控在铅致小鼠AD样病变中可能发挥作用。目的基于铅致AD淀粉样变的实验基础，以Aβ的形成和认知效应为观察终点，采用Res进行干预研究，围绕SIRTl及其效应分子FOXO3a、PGC-lα的表达，分析铅暴露、SIRTl相关的抗氧化应激效应与神经损伤之间的可能关系，为AD的病因及发病机制研究提供理论线索。方法1．动物模型建立：选用清洁级C57BL/6健康断乳（出生后21天）仔鼠35只作为研究对象，由本实验组进行仔鼠的繁育饲养。按体重随机分为五组：Res灌胃组、对照组、9M染铅组、9M染铅+Res灌胃组、3M染铅+Res灌胃组。以自由饮用2g/L醋酸铅溶液的方式进行铅暴露；与铅暴露三个月后进行白藜芦醇灌胃，剂量为50mg/kgBw d，每周连续灌胃6天后，停灌1天，持续六个月。2．行为学测试：染毒结束后，进行Morris水迷宫实验，测定小鼠空间学习记忆能力。3．组织提取：水迷宫实验结束后两天，进行小鼠麻醉后眼球采血，收集全血及脑组织，分离出皮层，生理盐水漂洗后，称重，置于冻存管中-80℃保存。4．实验室指标测定：用Z-5000偏振塞曼原子吸收光谱仪测定小鼠血铅；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测试试剂盒测定大脑皮层GSH-PX活力；还原型谷胱甘肽测试盒测定小鼠大脑皮层GSH含量；Aβ(1-40)ELISA试剂盒测定小鼠大脑皮层Aβ(1-40)含量；Western blot分析小鼠大脑皮层SIRT1、磷酸化FOXO3a（Ser253）、PGC-lα蛋白表达水平。结果1．Morris水迷宫结果：前五天小鼠的平均逃避潜伏期随日期变化逐渐减小（F=2.799,P<0.05）；9M染铅组、9M染铅+Res灌胃组的平均逃避潜伏期分别大于对照组、3M染铅+Res灌胃组（P<0.05），9M染铅组的平均逃避潜伏期大于Res灌胃组（P<0.05）。第6天撤去平台，9M染铅组和9M染铅+Res灌胃组的逃避潜伏期分别大于对照组、3M染铅+Res灌胃组（P<0.05）。2．小鼠血铅含量：各实验组小鼠血铅含量存在差异（F=92.21,P<0.001），Res灌胃组、对照组的血铅含量分别小于9M染铅组、9M染铅+Res灌胃组、3M染铅+Res灌胃组（P<0.001）；9M染铅组、9M染铅+Res灌胃组的血铅含量分别大于3M染铅+Res灌胃组（P<0.001）。3．GSH-Px活力值和GSH含量：各组小鼠大脑皮层GSH含量存在差异（F=6.177，P<0.05），Res灌胃组、对照组GSH含量高于9M染铅+Res灌胃组、9M染铅组（P<0.05），3M染铅+Res灌胃组GSH含量高于9M染铅组（P<0.05）。各组小鼠大脑皮层GSH-Px活力值存在差异（F=10.195,P<0.001），Res灌胃组GSH-Px活力值大于对照组（P<0.05），9M染铅组、9M染铅+Res灌胃组、3M染铅+Res灌胃组GSH-Px活力值小于对照组（P<0.05），3M染铅+Res灌胃组小鼠GSH-Px活力值大于9M染铅组（P<0.05）；4．Aβ(1-40)含量：各实验组小鼠大脑皮层Aβ(1-40)含量存在差异（F=3.285，P<0.05），9M染铅组Aβ(1-40)含量分别大于Res灌胃组、对照组、3M染铅+Res灌胃组（P<0.05）。5．Western blot分析结果：各实验组小鼠大脑皮层细胞核内SIRT1蛋白表达水平存在差异（F=216.779,P<0.001），对照组SIRT1水平高于其他各组（P<0.05），Res灌胃组、9M染铅+Res灌胃组、3M染铅+Res灌胃组SIRT1水平低于9M染铅组（P<0.05），Res灌胃组SIRT1水平高于3M染铅+Res灌胃组和9M染铅+Res灌胃组（P<0.05）。各实验组小鼠大脑皮层磷酸化FOXO3a表达水平存在差异（F=18.17，P<0.001），Res灌胃组磷酸化FOXO3a水平低于其他各组（P<0.05），对照组磷酸化FOXO3a水平则高于其他各组（P<0.05），9M染铅组磷酸化FOXO3a水平高于3M染铅+Res灌胃组（P<0.05）。各实验组小鼠大脑皮层总蛋白中PGC-lα表达水平存在差异（F=58.632,P<0.001），Res灌胃组PGC-lα表达水平高于对照组（P<0.05），9M染铅组、9M染铅+Res灌胃组、3M染铅+Res灌胃组PGC-lα表达水平均低于对照组（P<0.05），其中3M染铅+Res灌胃组PGC-lα表达水平高于9M染铅组；各实验组小鼠大脑皮层胞浆蛋白中PGC-lα表达水平也存在差异（F=67.327，P<0.001），Res灌胃组小鼠PGC-lα表达水平低于对照组（P<0.05），9M染铅组PGC-lα表达水平高于对照组（P<0.05），9M染铅+Res灌胃组、3M染铅+Res灌胃组PGC-lα表达水平均低于9M染铅组（P<0.05）且与对照组差异无统计意义（P>0.05）。结论1.发育早期铅暴露可降低小鼠大脑皮层中磷酸化FOXO3a、PGC-lα及大脑皮层细胞核内SIRT1表达水平，并增加PGC-lα在胞浆中的滞留，减少GSH-Px的酶活力以及GSH含量，降低抗氧化能力，损伤小鼠空间学习和记忆能力；2.白藜芦醇干预可能通过SIRTI的核质转运降低小鼠大脑皮层中的磷酸化FOXO3a表达水平、升高大脑皮层PGC-lα表达水平，增进PGC-lα去乙酰化后的核内转运及转录活性，增加GSH-Px的酶活力及GSH含量，提高抗氧化能力，对铅致小鼠空间学习记忆能力损伤有保护作用。