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研究背景及目的:大段骨缺损的治疗是骨科临床面临的难题,其核心问题是难以获取足量的高活性骨修复材料。选择性细胞滞留技术(selective cell retention,SCR)是贴近临床的组织工程骨构建策略,提高MSCs与材料的粘附效率是提高SCR构建的骨移植物成骨活性的关键。脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)是临床常用的SCR富集材料,可通过增加额外粘附位点、正电荷或表面修饰减少孔径等途径来改善其与细胞的粘附和骨诱导能力。故我们设计了一个带胶原结合域(CBD)的含IKVAV-cRGD结构域的肽(CBD-IKVAV-cRGD),修饰基于胶原的DBM,可发挥各自优势实现最大效能。该肽含多个整合素配体,分别与MSCs高表达的整合素亚型相结合,既能提高支架与细胞特异性粘附又可兼顾成骨诱导能力。方法:(1)选用兼顾MSCs特异性粘附和成骨诱导能力的IKVAV和cRGD肽,再选用可与DBM特异性结合的CBD,设计了CBD-IKVAV-cRGD和对照组CBD-IKVAV、CBD-cRGD肽的结构,并利用固态合成法及HPLC法等进行肽制备、纯化和验证,将三组肽修饰于DBM,随后利用激光共聚焦显微镜、环境扫描电镜等方法验证修饰的有效性和稳定性。(2)将课题组既往研究的DBM/LcRGD支架材料一并列入实验对照,利用震荡粘附实验、离心粘附实验、WesternBlog、CCK-8法、qPCR、碱性磷酸酶活性检测等方法检测CBD-IKVAV-cRGD肽对MSCs的粘附性能和成骨诱导能力。(3)以流式细胞仪、裸鼠股骨旁缺损成骨实验、micro-CT、病理切片等方法检测DBM/CBD-IKVAV-cRGD支架材料对骨髓中有核细胞的粘附能力和体内成骨效果。结果:(1)成功制备了高纯度的CBD-IKVAV、CBD-cRGD、CBD-IKVAV-cRGD肽,使用ESEM检测支架材料的形态特征。结果表明,与单纯DBM相比,DBM/CBD-IKVAV、DBM/CBD-cRGD和DBM/CBD-IKVAV-cRGD的表面微粗糙度增加。用带FITC荧光的三组肽修饰DBM后以激光共聚焦显微镜进行扫描重建,验证了修饰的有效性,随后将各组支架材料以PBS缓冲液进行高负荷模拟富集后再次扫描重建,结果显示各组肽经过高强度的冲洗后仍旧稳定地修饰于DBM表面。(2)细胞离心粘附实验及震荡粘附实验结果显示,相较于CBD-IKVAV、CBD-cRGD肽修饰组,CBD-IKVAV-cRGD肽对MSCs具备更强的粘附能力。CCK-8实验证实,利用MSCs细胞悬液进行SCR技术后,相对于DBM、DBM/CBD-IKVAV和DBM/CBD-cRGD组,DBM/CBD-IKVAV-cRGD支架材料滞留了更多MSCs,并且细胞密度最早达到峰值。将利用MSCs细胞悬液模拟SCR技术后的单纯DBM、DBM/CBD-IKVAV、DBM/CBD-cRGD、DBM/LcRGD和DBM/CBD-IKVAV-cRGD支架材料以成骨诱导培养基进行诱导培养后,以WesternBlot、qPCR和碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行检测,结果显示DBM/CBD-IKVAV-cRGD组的Runx2、ALP、OPN和OCN的基因表达水平和蛋白表达水平更高,同时可显著诱导FAK和ERK1/2的磷酸化水平,表明CBD-IKVAV-cRGD肽具有更好的诱导MSCs成骨分化能力。(3)利用健康成人骨髓将DBM、DBM/CBD-IKVAV、DBM/CBD-cRGD、DBM/LcRGD和DBM/CBD-IKVAV-cRGD支架材料以SCR技术进行富集,流式细胞术结果显示DBM/CBD-IKVAV-cRGD组对骨髓中CD90~+/CD105~+细胞、CD271~+细胞富集的绝对数量和后者在总有核细胞中的占比显著高于各对照组。以裸鼠股骨旁成骨模型检测富集后的单纯DBM和DBM/CBD-IKVAV-cRGD支架材料在体内的骨形成能力,Micro-CT和组织学观察均显示DBM/CBD-IKVAV-cRGD组支架材料具备更优的体内骨形成效果。结论:本研究设计并成功制备的CBD-IKVAV-cRGD肽,具备MSCs特异性表达整合素亚型的配基,用于DBM支架材料的表面修饰,在体外实验中增强了MSCs与支架材料的粘附能力和成骨分化诱导活性;应用于选择性细胞滞留技术中,可促进MSCs选择性滞留于支架材料中并促进其生长和成骨分化,体内试验证实增强了成骨活性。本研究设计的兼顾MSCs特异性粘附基团和DBM支架胶原结合基团的多功能人工肽实现了设计初衷,为增强细胞与支架材料特异性粘附的研究提供了新思路,展示出研发新型生物活性骨修复材料的应用前景。