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目的观察体外激素难治性前列腺癌细胞系冷冻消融后高迁移族蛋白B1 (high mobility group protein B1, HMGB1)表达的规律,及其与体外诱导异体外周血来源的树突状细胞(dendritic cell, DC)分化成熟的关系,初步探讨HMGB1对冷冻免疫反应的影响。材料和方法培养激素难治性前列腺癌细胞系PC-3,经冷冻消融(利用Endocare公司氩氦冷冻系统直径1.7mm冷冻器)裂解细胞后收集上清液,藉酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对冷冻前后上清液中的HMGB1进行定量分析。然后应用westernblot检测不同数量PC-3细胞冷冻坏死上清液中HMGB1的释放情况。采集前列腺癌患者抗凝的新鲜外周血,应用淋巴细胞分离液(Ficoll)用贴壁的方法分离单个核细胞(PBMC),经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4),体外诱导培养获取未成熟DC(imDC)。将PC-3细胞冷冻坏死上清液直接或加入足量HMHB1(?)(?)和抗体分别与imDC混合,在体外适宜培养条件下进行培养。倒置显微镜下观察细胞形态,进一步在共聚焦显微镜下观察DC骨架结构变化。流式细胞仪测定DC表而成熟共刺激分了分了CD83、CD86、HLA-DR的表达。观察HMGB1刺激与DC表面成熟共刺激分子CD83、CD86和HLA-DR表达的时-效关系及量-效关系。结果1.流式细胞术分析,冷冻消融前PC-3细胞正常、凋亡、坏死三种状态的比例分别为(95.58±1.23)%、(2.00±1.61)%、(0.56±1.09)%,冷冻消融后PC-3正常、凋亡、坏死三种状态的比例分别为(12.22±9.53)%、(5.46±1.14)%、(82.70±11.35)%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2. ELISA结果显示：1×106/ml组、1×107/ml组、1×108/ml组PC-3细胞上清液中HMGB1浓度分别由冷冻前的(4.59±0.25)ng/ml、(6.04±0.13)ng/ml、(7.39±0.18)ng/ml上升至(14.28±0.84)ng/ml、(71.68±4.62)ng/ml、(329.64±32.89)ng/ml,差异具有统计学意义(P<0.01)。western blot同样证实：随着PC-3细胞数量增加,冷冻坏死上清液中的HMGB1浓度也随之增加。3.树突状细胞经冷冻坏死上清液刺激后,微丝蛋白有所增加,细胞体积增大,触突变长变粗,应力纤维形成、胞浆溶胶增厚,细胞韧性和强度增加。冷冻坏死上清液中加入HMGB1中和抗体后,可见触突变短、变细,细胞膜周围和触突的荧光强度均减少,应力纤维生成减少、胞浆溶胶变薄。4.冷冻坏死上清液中的HMGB1诱导DC表面成熟共刺激分了高表达：冷冻刺激组,DC表面成熟共刺激分子CD83、CD86、HLA-DR表达较对照组上调明显(P<0.01)；抗体干预组,DC表面成熟共刺激分子CD83、CD86、HLA-DR表达较冷冻刺激组明显下降(P<0.01),但较对照组仍高(P<0.05)5.冷冻坏死上清液中的HMGB1诱导DC表面成熟共刺激分子表达的时-效关系：用浓度为1×106/ml的PC-3细胞冷冻坏坏死上清液分别与iDC共培养24h、48h和72h,DC表面成熟共刺激分子CD83、CD86和HLA-DR表达分别于24～72h明显上调(P<0.05,P<0.01),其中以培养48h组DC表面共刺激分子表达上调最为显著(P<0.01)。6.冷冻坏死上清液中的HMGB1诱导DC表面成熟共刺激分了表达的量-效关系：与空白对照组相比,1×106/ml、1×107/ml组DC表面共刺激分子CD83、CD86、HLA-DR明显上调(P<0.05,P<0.01),1×108/ml组DC表面仅CD83表达明显上调(P<0.05),CD86、HLA-DR无明显变化(P>0.05)结论冷冻消融导致肿瘤细胞坏死,坏死肿瘤细胞释放HMGB1作为一种内源性危险信号,可使DC细胞骨架发生变化,增强其游走迁移能力,促使免疫突触形成,方便其进入淋巴结,与T细胞作用引发免疫反应,从而启动特异性T细胞免疫应答。同时,HMGB1在冷冻免疫反应中具有双重调节作用,低浓度的HMGB1可作为重要的免疫刺激信号,促进DC表面成熟共刺激分子高表达,并在一定时间内达到作用强度峰值；高浓度的HMGB1则使DC表面成熟共刺激分子表达受到抑制,对DC免疫功能活化起到一定的抑制作用。