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研究目的：自噬好比中医的阴阳,阴阳平衡,自噬适度,可帮助受损细胞清除受损的细胞器和异常蛋白,从而对细胞损伤起保护作用。但是当阳偏盛,自噬过度,与凋亡信号之间交互作用,会诱导细胞死亡。阴偏盛,自噬降低,坏死的细胞器未及时清除,影响细胞代谢。自噬作为一种新的缺血性脑损伤的干预靶点正得到越来越多的共识,近年来也有一些临床前研究以干预自噬为靶点对中枢神经系统疾病进行治疗,这也可能成为脑卒中基础研究与潜在临床应用的新热点。对自噬的分子生物学机制的深入研究和探索,将有助于寻找新的药物干预分子靶点。本课题组前期实验研究发现左旋樟脑能作用于GABAA受体达到抑制凋亡效应,并且能靶向P53抑制脑缺血再灌注损伤后自噬的过度激活,起到神经细胞保护作用。而大量研究发现miRNA参与癌细胞免疫逃逸、免于凋亡而无限增殖。因此能否将两者结合起来,探究左旋樟脑是否通过靶向特定miRNA起到调节自噬的作用,这将有助于寻找新的药物干预分子靶点,为中医药防治脑血管疾病的发展提供新的思路。研究方法：1.通过线栓法制作大鼠MCAO模型,采用Longa神经学评分判断是否造模成功,并观察左旋樟脑作用24h能否改善脑缺血再灌注模型的神经学评分。取大脑皮质,经qRT-PCR实验观察前期筛选的miR-140在左旋樟脑作用下的表达情况。2.构建miR-140启动子的双荧光素酶报告基因转染PC12细胞,在血清饥饿诱导下,观察miR-140启动子的转录活性：观察左旋樟脑在血清饥饿诱导下,对miR-140启动子转录活性的影响。3.生物信息学预测miR-140可能存在的相关靶点,构建特异性表达的rno-miR-140-3p模拟物和抑制物,转染PC12细胞经Western Blot进行功能性验证；通过构建靶基因-3’UTR区含rno-miR-140-3p的结合位点的双荧光素酶报告基因明确miR-140的靶基因。4. rno-miR-140-3p模拟物和抑制物转染PC12细胞后,无血清诱导同时左旋樟脑作用情况下,采用免疫荧光观察自噬相关蛋白LC3表达情况,Western blot法检测凋亡相关蛋白(BCL-XL、 caspase-3)和自噬相关蛋白(LC3、 P62)表达情况。5. rno-miR-140-3p激动剂和rno-miR-140-3p拮抗剂侧脑室注射MCAO模型大鼠,观察miR-140高表达与低表达对MCAO模型大鼠凋亡相关蛋白影响。研究结果：1.左旋樟脑能改善脑缺血再灌注损伤模型的行为学障碍,q RT-PCR结果显示左脑樟脑能抑制脑缺血再灌注下的miR-140升高。2.血清饥饿诱导下,miR-140启动子转录活性升高,但是左旋樟脑能抑制血清饥饿诱导下miR-140启动子的转录活性升高。3.经生物信息学预测rno-miR-140-3p的潜在靶点是Bcl-xl,经Western Blot和报告基因验证后,确定rno-miR-140-3p能靶向抑制Bcl-xl表达。4. rno-miR-140-3p模拟物能抑制血清饥饿诱导下Bcl-xl和P62的表达,促进caspase-3和LC3表达；而左旋樟脑和rno-miR-140-3p抑制物能促进血清饥饿诱导下Bcl-xl及P62的表达,抑制caspase-3和LC3表达,而当左旋樟脑与rno-miR-140-3p抑制物合用时,上述结果更为明显。5. rno-miR-140-3p激动剂能抑制MCAO模型大鼠Bcl-xl蛋白,促进caspase-3蛋白表达；而rno-miR-140-3p拮抗剂能促进MCAO模型大鼠Bcl-xl蛋白,抑制caspase-3蛋白表达。研究结论：左旋樟脑能通过抑制自噬起到神经保护作用,其机制之一是通过靶向抑制miR-140的表达,使BCL-XL蛋白上调,达到抑制细胞凋亡和自噬,起到神经保护作用。