角膜病致盲率位居全球第二,同时它也是国内第二大致盲眼病。同种异体角膜移植是目前治疗不可逆性角膜盲最有效的方法,但角膜供体来源的极度匮乏使其应用受到了限制。生物工程角膜材料来源丰富,生物相容性好,因此能够有效地缓解天然角膜极其匮乏的压力,社会意义重大,经济效益显著。生物工程角膜的构建是将体外扩增的种子细胞(包括角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞)种植于支架材料上,经过体外三维培养形成与天然角膜在结构和功能上相似的角膜植片替代物。支架材料和种子细胞是两大关键要素,也是目前生物工程角膜研究的热点和难点。目前大部分支架材料因生物相容性、透明度或机械强度的不足而仅限于组织学、生理、病理、毒理、药理及角膜损伤等方面的基础研究。我们课题组前期研制的脱细胞猪角膜基质(acellular porcine corneal matrix, APCM),所含异种细胞及遗传物质被完全脱除,其天然胶原排列结构得到了的保留,具有良好的透光性、机械力学性能以及生物相容性,并已成功应用于兔角膜前板层的构建。但是APCM是否能够支持角膜内皮细胞的生长并且形成功能性的角膜内皮结构,仍是目前研究的空白。生物工程角膜内皮的构建可为角膜内皮细胞相关性的基础研究提供良好的体外模型,也可为今后全层生物工程角膜的研制奠定技术基础,同时还可成为临床上单纯角膜内皮移植手术潜在的供体植片来源,具有较高的研究价值和意义。生物工程角膜内皮的构建需要充足的内皮细胞供给,人类角膜内皮细胞缺乏增殖能力,难以在体外大量扩增培养,因此寻找新的内皮细胞来源成为亟待解决的问题。目前由于尚未找到理想的内皮细胞来源,大部分有关生物工程角膜内皮构建的研究都是利用增殖能力相对较强的低等动物的角膜内皮细胞或永生化人角膜内皮细胞系等,此类生物工程角膜内皮可用于体外实验研究,但是尚难以满足临床应用的要求。神经嵴千细胞是角膜内皮细胞的前体细胞,其来源充足(可在体外由胚胎干细胞诱导分化而来),如能将其诱导分化为角膜内皮细胞,将为生物工程角膜内皮的构建提供新的内皮细胞来源。鉴于以上问题,本研究首先以后板层APCM为支架,探讨了其与人角膜内皮细胞的生物相容性,证实后板层APCM支架可支持人角膜内皮细胞系B4G12的生长,并形成具备一定泵功能的生物工程角膜内皮,可作为良好的人角膜内皮体外模型而应用于基础研究；其次,本研究探讨了将大鼠神经嵴干细胞诱导分化为角膜内皮细胞的可行性,筛选出成功的诱导方案,获得了在形态和功能上接近正常角膜内皮细胞的角膜内皮样细胞；最后,我们利用后板层APCM支架、角膜内皮样细胞及原代培养的角膜基质细胞构建了无上皮生物工程角膜,并初步尝试进行动物穿透性角膜移植实验,结果显示术后植片上皮可自我修复,并且植片具备一定的内皮泵功能,病理染色显示植片基质内有大量炎细胞样细胞浸润,提示出现免疫排斥反应,今后在植片的构建方法、实验动物的选择及手术操作方法等方面尚需改善。第一部分利用后板层APCM支架和人角膜内皮细胞系构建角膜内皮体外模型的实验研究[目的]探讨以后板层APCM为支架,以人角膜内皮细胞系为种子细胞构建角膜内皮体外模型的可行性。[方法]1.后板层APCM支架的制备：无菌条件下板层分离新鲜猪角膜,留取约1/2厚度的后板层组织,用含有1%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液充分洗涤后将其置于0.5%无菌SDS溶液中于4°C条件下脱细胞24小时。随后用无菌磷酸盐缓冲液充分漂洗脱细胞后的组织,于-200C条件下冻干12小时,生物安全柜内自然风干3小时,-20°C保存备用。2.后板层APCM支架的形态和细胞毒性检测：HE染色检测后板层APCM中细胞脱除情况,MTT法检测后板层APCM浸提液对人角膜内皮细胞系增殖活性的影响。3.人角膜内皮细胞B4G12的培养：用层粘连蛋白与硫酸软骨素混合液包被培养瓶底壁,于常规条件下用含有人重组碱性成纤维细胞生长因子的人内皮细胞无血清培养基培养B4G12细胞,0.05%胰酶-0.02%EDTA常规消化传代。4.生物工程角膜内皮的构建：解剖显微镜下切取直径约为8mm、厚度约为1mm的后板层APCM,将其置于B4G12细胞培养基中于37°C浸泡24小时后,后弹力层面向上将其置于24孔板内,自然风干表面。调整B4G12细胞接种密度为2000个/mm2,将细胞悬液轻轻滴于APCM后弹力层面,待细胞贴附后补足培养基至整个APCM支架上表面被浸没。对所构建生物工程角膜内皮进行扫描电镜检测,台盼蓝-茜素红S双染色、HE染色、免疫荧光染色检测闭锁小带蛋白-1(zonula occluden-1, ZO-1)、Na+/K+ATP酶的表达情况以及角膜肿胀实验检测内皮泵功能。[结果]HE染色显示后板层APCM支架中细胞及遗传物质成分被完全去除,胶原排列结构及后弹力层保留完好。MTT实验结果证实后板层APCM浸提液对B4G12细胞生长曲线无影响(P>0.05)。B4G12细胞种植于后板层APCM支架后,台盼蓝-茜素红S双染色显示多边形细胞相互之间连接紧密,形成完整的单细胞层覆盖APCM后弹力层面,平均细胞密度为2061±344个/mm2。HE和DAPI染色证实仅在APCM后弹力层面有单层细胞结构,而APCM基质中不含有任何细胞及其核物质。免疫荧光染色显示B4G12细胞在APCM支架上表达功能相关性蛋白ZO-1和Na+/K+ATP酶。角膜肿胀实验结果显示Na+/K+ATP酶抑制剂乌巴因可诱发角膜基质水肿,使得角膜基质厚度增加51.7%,而不含乌巴因组仅产生可逆性的角膜基质水肿,从而间接证明所构建生物工程角膜具有一定的泵功能。[结论]利用后板层APCM支架和B4G12构建的生物工程角膜内皮具备与天然角膜内皮类似的结构与功能,可作为内皮相关性研究良好的体外模型。第二部分大鼠神经嵴干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究[目的]探讨体外诱导大鼠神经嵴干细胞分化为功能性角膜内皮样细胞的可行性。[方法]1.大鼠神经嵴干细胞的原代培养及鉴定：取9天孕龄大鼠胚胎,从背侧暴露神经管,用细针头挑取前十个体节的神经管组织,将其置于事先由纤维连接蛋白包被的培养皿中贴壁培养,48小时后去除神经管组织,继续培养已迁移出的神经嵴干细胞,0.05%胰酶-0.02%EDTA常规消化传代；免疫荧光实验检测神经嵴干细胞标记物P75和HNK-1的表达。2.大鼠角膜内皮细胞的原代培养：取新鲜大鼠角膜,充分漂洗后浸泡于培养基中于37℃过夜孵育以稳定细胞活性；次日将浸泡有大鼠角膜的培养基离心,弃上清后加入0.02%EDTA,于37℃条件下消化1小时,轻轻吹打角膜以促进内皮细胞从后弹力层脱落；吹打完毕后离心弃上清,用内皮细胞培养基重新悬浮细胞沉淀,常规条件下培养。3.条件培养基的配制：待大鼠角膜内皮细胞生长至70%-90%满时,每12小时提取一次细胞培养上清液,过滤后-800C保存；将内皮细胞上清液与神经嵴干细胞培养基分别按照1：3,1：1和3：1的比例混合,得到内皮细胞上清液浓度分别为25%、50%和75%的条件培养基。4.神经嵴干细胞的诱导分化及角膜内皮分化标记物的鉴定：分别用条件培养基法及细胞共培养法诱导培养大鼠神经嵴干细胞,每日观察细胞生长情况及形态变化,初步筛选出使神经嵴干细胞向角膜内皮细胞分化的方案后,对诱导细胞进一步进行角膜内皮细胞分化标记物的鉴定,具体实验分组如下：1)条件培养基法：A：细胞外基质包被组：用层粘连蛋白和硫酸软骨素包被6孔板底壁,分别用25%,50%和75%的条件培养基诱导培养神经嵴干细胞；B：无包被对照组：对6孔板底壁不进行包被,分别用25%,50%和75%的条件培养基诱导培养神经嵴干细胞；2)细胞共培养法：A：细胞外基质包被组：用层粘连蛋白和硫酸软骨素包被Transwell小室聚碳酸酯膜的上室面,将大鼠神经嵴干细胞与角膜内皮细胞按照1：1,1：5,1：10及1：20的数量比分别接种于Transwell小室的上室和下室内,进行共培养诱导；B：无包被对照组：不对Transwell小室聚碳酸酯膜进行包被,将大鼠神经嵴干细胞与角膜内皮细胞按照1：1,1：5,1：10及1：20的数量比分别接种于Transwell小室的上室和下室内,进行共培养诱导；收集有阳性变化的诱导细胞,利用免疫荧光法检测诱导细胞角膜内皮细胞分化标记物N型钙粘素、ZO-1和Na+/K+ATP酶的表达；利用流式细胞仪进一步检测细胞诱导分化率；利用实时定量聚合酶链式反应(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测角膜内皮分化相关基因FoxCl和Pitx2的表达。5.角膜内皮样细胞动物移植：用液氮冷冻法制造角膜内皮功能不全大鼠模型,将角膜内皮样细胞制成细胞悬液并用荧光染料标记后,调整细胞接种密度为3000个/mmm2,利用前房注射的方法将角膜内皮样细胞移植于术眼角膜的后弹力层面,以空白模型为对照组,术后定期进行裂隙灯观察、激光共聚焦角膜显微镜观察以及标本的组织学染色,评价角膜内皮样细胞的体内功能和生物安全性。[结果]神经管贴壁48小时后可见有纤维样细胞从其周围迁移出,免疫荧光检测显示这些细胞同时表达神经嵴干细胞标记物P75和HNK-1,证实其为神经嵴干细胞。诱导实验结果显示,细胞外基质包被联合75%条件培养基+10%胎牛血清诱导培养1周后,神经嵴干细胞出现形态变化,小部分细胞由纤维样转变为多边形,2周后约有40%-50%的细胞发生形态变化,继续延长诱导时间不能增加多边形细胞的比例。免疫荧光检测证实所得多边形细胞表达角膜内皮分化标记物N型钙粘素；经流式细胞仪分析,N钙粘素阳性的细胞约占细胞总数的40%-50%,与镜下观察结果一致。RT-PCR结果证实多边形细胞表达角膜内皮分化相关基因FoxCl和Pitx2。角膜内皮样细胞动物移植术后手术组大鼠角膜逐渐恢复透明,水肿逐渐减轻,1个月后角膜可恢复正常透明度和厚度,而对照组大鼠角膜持续水肿混浊。激光共聚焦角膜显微镜观察可见手术组大鼠角膜后弹力层被多边形细胞覆盖,细胞密度约为2872.6±172.7个/mm2,而对照组大鼠角膜后弹力层未见有细胞覆盖。手术组大鼠角膜HE染色显示其后弹力层有单细胞层贴附,内皮面在荧光显微镜下可见绿色荧光,证实该单细胞层为角膜内皮样细胞,术眼角膜内未见有异常新生物或炎细胞样细胞浸润,对照组大鼠角膜HE染色显示其后弹力层面无细胞附着,荧光显微镜下无荧光信号。[结论]利用条件培养基法可将大鼠神经嵴干细胞诱导分化为功能性角膜内皮样细胞。第三部分构建无上皮生物工程角膜及其动物移植的初步实验研究[目的]探讨利用后板层APCM支架、角膜内皮样细胞及角膜基质细胞构建无上皮生物工程角膜的可行性及其动物移植效果评价。[方法]1.同前法制备后板层APCM支架,利用条件培养基法诱导培养角膜内皮样细胞。2.兔角膜基质细胞的原代培养：取新鲜兔角膜,在解剖显微镜下撕去后弹力层,然后将角膜剪成小块,用胶原酶消化后去除上皮层,将残留基质碎块贴壁培养,待基质细胞迁移出后移除基质块,继续培养迁移出的基质细胞,常规消化传代。3.无上皮生物工程角膜的构建及兔穿透性角膜移植实验：将基质细胞制成细胞悬液,分别从8个方向将其用胰岛素针注射入制备好的后板层APCM支架中,常规条件下培养并逐步增加角膜内皮样细胞培养基的比例,逐步驯化基质细胞使其适应角膜内皮样细胞培养环境,驯化完成后将角膜内皮样细胞种植于后板层APCM支架的后弹力层面,常规培养2周后行兔穿透性角膜移植实验,以后板层APCM空支架为对照,用羊膜覆盖植片表面,术后每日典必殊眼水点眼4次,典必殊眼膏1次,裂隙灯定期观察,并取材行病理检查。[结果]术后1周术眼结膜充血,分泌物较多,羊膜溶解并自然脱落,生物工程角膜植片及APCM空支架植片水均明显水肿,荧光素染色显示生物工程角膜植片约70%区域的上皮已修复,而APCM空支架植片上皮修复缓慢且表面不光滑。术后2周炎症反应略有减轻,生物工程角膜植片水肿有所消退,有溶解迹象,荧光素染色显示植片上皮已基本修复,APCM空支架植片水肿程度较为严重,上皮层基本修复,但是表面欠光滑。角膜标本HE染色可见生物工程角膜植片基质内有大量炎细胞样细胞,胶原纤维排列较为致密,角膜内皮样细胞贴附良好,APCM空支架植片基质内炎细胞样细胞较少,胶原纤维排列疏松,有大量空泡。[结论]无上皮生物工程角膜植片移植术后其上皮可自行修复,植片具有一定的内皮泵功能,术后免疫排斥反应明显,今后在植片的构建、手术操作及实验动物的选择方面尚需改良。