猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是猪肠道冠状病毒家族中的新成员,主要引起新生仔猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,严重威胁着养猪业的健康发展。除了感染猪,PDCoV还可以感染鸡、火鸡、小鼠和牛。最近,有研究报道从急性发热性疾病患儿的血浆样本中分离到PDCoV,说明PDCoV还可以感染人。作为一种新发现的病毒,目前对PDCoV的感染、致病和免疫机制的研究尚不深入,没有用于预防PDCoV感染的商品化疫苗,也没有用于治疗PDCoV感染的特效药物。因此,深入研究PDCoV与宿主的相互作用,筛选与病毒感染相关的宿主因子,发掘潜在的抗病毒药物靶标,对有效控制PDCoV感染及保障人类健康具有重要意义。本研究利用猪全基因组范围的single-guide RNA（sgRNA）慢病毒文库,对PDCoV感染相关的宿主因子进行了筛选,并对其中的两个分子TMEM41B（transmembrane protein 41B）和SLC35A1（solute carrier family 35 member A1）进行了深入研究。具体研究内容如下:1.利用猪全基因组CRISPR敲除文库筛选PDCoV感染相关的宿主因子将两个猪源sgRNA慢病毒文库（A库和B库）分别接种稳定表达Cas9的LLC-PK1细胞系,经嘌呤霉素筛选,获得两个全基因组敲除的LLC-PK1细胞库（LLC-PK1 GeCKO细胞库）。将PDCoV以0.1 MOI的剂量分别接种两个LLC-PK1 GeCKO细胞库,对存活的细胞扩大培养后再用PDCoV进行第二轮感染,如此共进行五轮感染。分别提取不接毒的空白细胞、第二轮和第五轮感染后存活细胞的基因组DNA进行高通量测序。根据测序结果选取从A库、B库筛选到的相同基因中排序前50的基因进行验证。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建分别敲除这50个基因的LLC-PK1多克隆细胞系,接种PDCoV后通过细胞病变观察和间接免疫荧光（IFA）检测,发现TMEM41B、SLC35A1、SNX10（sorting nexin 10）、VOPP1（vesicular overexpressed in cancer pro-survival protein 1）、PCSK6（proprotein convertase subtilisin/kexin type 6）敲除后对PDCoV的增殖有显著的抑制作用。其中以敲除TMEM41B的作用最为明显,而SLC35A1是唾液酸（Sialic acid,SA）的转运体,考虑到糖受体在冠状病毒感染中的重要作用,因此,选择TMEM41B和SLC35A1进行了深入研究。2.TMEM41B在PDCoV增殖中的作用与机制研究在证实敲除TMEM41B抑制PDCoV的增殖后,进一步对敲除TMEM41B的LLC-PK1多克隆细胞系进行亚克隆,获得了敲除TMEM41B的LLC-PK1单克隆细胞系（TMEM41B-KO）。用PDCoV感染该细胞系后,通过空斑实验、TCID50测定或RT-q PCR检测,发现敲除TMEM41B主要影响PDCoV感染周期的复制阶段。在此基础上,通过IFA或直接荧光观察的方式检测了敲除TMEM41B对其它几种病毒增殖的影响,发现敲除TMEM41B显著抑制猪新型甲型冠状病毒（SADS-Co V）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、鼠肝炎病毒（MHV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的增殖,但对伪狂犬病毒（PRV）、水泡性口炎病毒（VSV）和猪轮状病毒（Po RV）的增殖无明显影响,说明TMEM41B可能是一个泛冠状病毒宿主因子。TMEM41B是一种定位于内质网的多重跨膜蛋白,为了确定其发挥作用的关键结构域,在预测与分析TMEM41B的结构域和跨膜区的基础上,构建了一系列截短突变体（分别缺失NTD、VTT、TM6、CTD、TM6+CTD）的真核表达质粒,分别转染TMEM41B-KO的LLC-PK1细胞,通过RT-q PCR及Western blot检测发现缺失VTT、TM6和TM6+CTD的突变体不能恢复PDCoV的感染,说明VTT结构域和第6个跨膜区（TM6）是TMEM41B促进PDCoV感染的关键结构域。由于缺失TM6的突变体表达量较低,不能排除其对PDCoV增殖的影响是因其表达量较低所致。因此,根据各突变体对PDCoV增殖的影响,选择缺失TM6+CTD的突变体进行研究。首先通过分子模拟证实缺失TM6+CTD不影响TMEM41B的VTT结构域,于是在TMEM41B-KO细胞系的基础上构建了稳定表达e GFP、TMEM41B-WT或TMEM41B△（TM6+CTD）的细胞系,同时构建了精准缺失TMEM41B TM6+CTD的LLC-PK1细胞系。用PDCoV感染后通过IFA和Western blot检测,发现PDCoV不能在表达TMEM41B△（TM6+CTD）的TMEM41B-KO细胞系上增殖,也不能在精准缺失TMEM41B TM6+CTD的LLC-PK1细胞上增殖,说明TM6+CTD是TMEM41B促进PDCoV增殖的关键结构域。诱导自噬和维持胞内脂滴稳态是目前已知的TMEM41B的主要生理功能,进一步分析发现缺失TM6+CTD并不影响TMEM41B诱导自噬和维持胞内脂滴稳态的能力,说明缺失TM6+CTD可能不影响TMEM41B的主要生理功能。为了检测鼠源TMEM41B TM6+CTD结构域对MHV增殖的影响,构建了精准缺失TMEM41B TM6+CTD的L929细胞系,并通过IFA、TCID50和Western blot检测了MHV的感染情况,结果发现MHV不能感染TMEM41B-KO和精准缺失TMEM41B TM6+CTD的L929细胞。上述研究结果说明TMEM41B的TM6是其促进PDCoV以及其它冠状病毒增殖的关键结构域。3.SLC35A1在PDCoV增殖中的作用与机制研究SLC35A1是细胞表面唾液酸（Sialic acid,SA）合成通路中的关键分子之一。为了研究SLC35A1在PDCoV增殖中的作用,对此前获得的敲除SLC35A1的LLC-PK1多克隆细胞系进行了亚克隆,建立了敲除SLC35A1的LLC-PK1单克隆细胞系（SLC35A1-KO）,同时构建了敲除SLC35A1的IPI-FX细胞系。通过WGA-Binding实验对获得的细胞系及野生型细胞表面的SA进行检测,发现敲除SLC35A1后LLC-PK1和IPI-FX细胞表面SA的含量均显著降低,说明敲除SLC35A1影响细胞表面SA的合成。IFA和TCID50检测发现PDCoV在SLC35A1敲除细胞中的增殖能力明显降低,说明SA可促进PDCoV的感染。进一步检测发现SA主要促进PDCoV感染细胞的吸附阶段,而胰酶可促进PDCoV对SA的利用。随后比较了不同猪肠道冠状病毒对SA的依赖性,发现TGEV、SADS-Co V对SA的依赖程度与PDCoV相似,而PEDV不同毒株对SA的依赖性存在差异,变异毒株AJ1102高度依赖SA,但经典毒株JS2008的感染不受SA的影响。为了确定PDCoV结合SA的关键区域或氨基酸位点,通过生物信息学预测了PDCoV S蛋白中与SA结合的潜在区域或氨基酸位点（160-169 aa、H148、T182）,利用反向遗传操作系统构建了S基因160-169aa突变（rPDCoV Sα-mut（aa160-169））、H148点突变（rPDCoV S H148A/D/K）、T182点突变（rPDCoV S T182A）的重组病毒,将拯救的重组病毒分别感染WT和SLC35A1-KO的LLC-PK1细胞,发现rPDCoV S H148A/D/K、rPDCoV Sα-mut（aa160-169）与rPDCoV WT一样,对WT LLC-PK1细胞的感染率明显高于SLC35A1-KO的LLC-PK1细胞,而rPDCoV S T182A对两种细胞的感染率无明显差异,且显著低于rPDCoV WT对WT LLC-PK1细胞的感染率,说明PDCoV S蛋白H148或160-169aa突变不影响PDCoV与SA的结合,而T182突变影响PDCoV与SA的结合,是PDCoV与SA结合的关键氨基酸位点。鉴于SLC35A1调控SA合成,SA又是影响PDCoV吸附的辅助受体,而氨肽酶N（amino peptidase N,APN）是目前已报道的PDCoV的另一辅助受体,为了比较APN与SA在PDCoV感染中的作用,构建了SLC35A1和APN双敲除的LLC-PK1细胞系（SLC35A1+APN-DKO）。用PDCoV分别感染WT、SLC35A1-KO、APN-KO和SLC35A1+APN-DKO的LLC-PK1细胞,通过IFA检测PDCoV在不同细胞系上的感染效率,结果发现同时敲除SLC35A1和APN对PDCoV感染的影响最大,其次是单独敲除SLC35A1,而单独敲除APN对PDCoV感染的影响最小,说明SLC35A1是PDCoV感染相关的重要宿主因子,SA是PDCoV的辅助受体,并且其在PDCoV感染中的作用强于APN。