【摘 要】
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猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）,又称猪德尔塔冠状病毒或猪丁型冠状病毒,属于冠状病毒科,δ冠状病毒属成员,是一种主要感染仔猪的新型肠道冠状病毒,引起严重的肠炎并表现出腹泻、呕吐、脱水的临床症状。PDCoV在猪群中流行广泛,但目前没有防控该病的疫苗或治疗的药物,给畜牧业带来一定的经济损失。因此,研制有效的疫苗具有重要意义。在冠状病毒感染过程中,S蛋白可诱导
【基金项目】
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国家重点研发计划:猪重要疫病的诊断与检测新技术研究（项目编号:NO.2016YFD0500700）；
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猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）,又称猪德尔塔冠状病毒或猪丁型冠状病毒,属于冠状病毒科,δ冠状病毒属成员,是一种主要感染仔猪的新型肠道冠状病毒,引起严重的肠炎并表现出腹泻、呕吐、脱水的临床症状。PDCoV在猪群中流行广泛,但目前没有防控该病的疫苗或治疗的药物,给畜牧业带来一定的经济损失。因此,研制有效的疫苗具有重要意义。在冠状病毒感染过程中,S蛋白可诱导机体产生保护性的中和抗体。本研究拟分段表达PDCoV S蛋白,制备并鉴定其特异性多克隆抗体,利用病毒中和试验（Virus neutralization assay,VN assay）、荧光焦点中和试验（Fluorescent focus neutralization assay,FFN）及噬斑减少中和试验（Plaque-reduction neutralization tests,PRNT）检测抗体的中和活性,以鉴定PDCoV S蛋白的免疫优势区,为基于PDCoV S蛋白免疫优势区的亚单位疫苗设计奠定基础。为了鉴定PDCoV S蛋白的免疫优势区,本研究依据冷冻电镜已解析的S蛋白结构,将S蛋白分为S1-NTD（50-286 aa）、S1-CTD（278-616 aa）以及S2（601-1087aa）三段进行原核表达,将纯化后的蛋白稀释为相同浓度,以猪抗PDCoV多克隆抗体为一抗,western blot验证截短S蛋白反应原性,结果显示,S1-CTD融合蛋白与PDCoV的多克隆抗体具有较强反应性;以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,三免后10d收集血清,VN assay及FFN测定血清中和抗体效价,结果显示三种蛋白的多克隆抗体都能够在体外抑制PDCoV感染,其中抗S1-CTD多克隆抗体抑制PDCoV感染的能力最强。为验证S1-CTD是否持续诱导机体产生较强的中和抗体,将三个重组蛋白以相同的浓度免疫BALB/c小鼠,并每周监测抗体反应。利用VN assay、FFN及PRNT进一步分析各重组蛋白多克隆抗体的中和活性,确定PDCoV S蛋白的免疫优势区。VN assay结果显示,第二次免疫后,小鼠血清中抗PDCoV多克隆抗体滴度显着提高,并且抗S1-CTD多克隆抗体在各个时间点始终具有最高的中和抗体效价,在初次免疫后第4周,免疫S1-CTD蛋白的小鼠中和抗体滴度显著升高,抗体滴度为1:545（±81.7）。同样,通过FFN和PRNT分析,在初免后第4周收集的抗S1-CTD多克隆抗体的中和效价（1:320）也显著高于NTD组及S2组。本研究结果表明,在PDCoV S蛋白中,S1-CTD区域在病毒感染过程中具有重要作用,是诱导中和抗体产生的优势抗原区域,为后续开展S蛋白的免疫研究奠定了基础。
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