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本研究在前期已有的研究基础上,筛选诃子(Terminalia Chebula Retz.)和虎杖(Rhizoma Polygoni Cuspidati)两种对水产致病菌具有较好抑菌作用的中药,采用超声波辅助提取法和高速逆流色谱法对其有效组分进行提取分离,以建立高效、快速、准确的分离方法。嗜水气单胞菌(B11)和维氏气单胞菌(B59)是气单胞菌中危害较大的两种菌,可引起多种水产动物发生疾病。本研究采用微量热法测定中药各分离组分对这两株菌的体外抑菌效果,初步探讨中药抗菌组分的最佳抑菌浓度。根据抑菌作用的结果,选择抑菌活性高的一个单体成分进行活体实验,以人工感染嗜水气单胞菌的斑马鱼作为疾病模型,从鱼体的非特异免疫指标水平和死亡率来探讨其药效。主要结果如下:1、采用超声波辅助提取法对中药诃子进行粗提,设计L9(34)正交试验,考察乙醇浓度、料液比、超声温度和超声时间四个因素,优化诃子鞣质类成分的超声提取工艺。最佳工艺条件为:乙醇浓度60%,料液比1:20,温度50℃,提取时间80 min,4个因素对诃子中没食子酸提取率影响的大小顺序为:A(乙醇浓度)>D(超声时间)>B(料液比)>C(超声温度)。在该条件下,诃子中没食子酸的提取量为10.80 mg/g。2、本研究对中药诃子的主要抗菌组分进行提取分离,分析型高速逆流色谱确定诃子醇提物的分离体系为:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:5:1:5,v/v),放大于制备型高速逆流色谱上进行分离制备,根据色谱峰,可分离得到4个组分(T1?T4)。微量热结果表明,4个分离组分对菌株B11和菌株B59均具有抑制作用,抑菌强弱依次为:T3>T2>T4>T1,其中组分T3对菌株B11和菌株B59的最佳抑菌浓度分别为0.56 mg/mL和0.74 mg/mL。经HPLC纯度分析,组分T3的纯度为96.4%,质谱鉴定为没食子酸。3、本研究对中药虎杖的主要抗菌组分进行提取分离,分析型高速逆流色谱确定虎杖醇提物的分离体系为:氯仿-甲醇-水(4:3.8:2,v/v),放大于制备型高速逆流色谱上进行分离制备,可获得5个组分(R1?R5)。微量热结果表明,组分R1和R5对两株试验菌株具有抑制作用,抑菌强弱为:R1>R5,其中组分R1对B11的最低抑菌浓度为1.58 mg/mL,对B59的最低抑菌浓度为1.14 mg/mL。经HPLC分析,组分R1含有两个成分,其中一个成分推测为大黄素。4、以斑马鱼为试验鱼,将没食子酸分别按质量为0.3%、0.6%、1.2%、2.4%的比例添加到基础饲料中,饲喂14 d,并测定总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)的活性变化。结果表明没食子酸可以增强鱼体的非特异免疫性功能,0.6%组和1.2%组的4种酶活均在第10 d显著高于对照组。饲喂药饵14 d后,将斑马鱼人工感染嗜水气单胞菌,结果表明没食子酸添加组的斑马鱼死亡率与对照组相比有所降低,1.2%组和2.4%组的死亡率显著低于对照组,较对照组分别降低25%和20%。综上所述,超声波辅助萃取法适合诃子中没食子酸的提取,在优化的工艺条件下,没食子酸的提取量为10.80 mg/g。高速逆流色谱法对两种中药的主要抑菌成分进行分离,并结合微量热结果得知,诃子4个分离组分(T1?T4)对试验菌株均有抑制作用,其中T3(没食子酸)是诃子的主要有效抑菌成分;虎杖组分R1和R5对两株试验菌株具有抑制作用,其中,大黄素为组分R1中的一种成分。活体试验表明,没食子酸可以提高鱼体的非特异免疫力,从而增加其抗病力,对细菌性疾病具有一定的预防作用。