论文部分内容阅读
背景与目的癫痫(epilepsy,EP)是常见的神经系统疾病,目前尚未明确癫痫的具体发病机制,抗癫痫药物不能控制疾病的进展,终止症状使大脑对反复痫性发作更敏感,随着时间的进展这种敏感性更加严重,这就要求我们进一步研究癫痫的发病机制,为癫痫治疗寻找新靶点。线粒体对神经递质合成、钙稳态、氧化还原反应、活性氧的产生与调节以及神经元凋亡起关键作用,线粒体功能障碍导致癫痫发作过程中氧化应激增加,损伤线粒体DNA,引起脂质过氧化,影响ATP利用,这些反应对抗内源性抗氧化机制的保护作用,导致神经网络重组、神经元丢失、神经干细胞移位,最终导致癫痫发作,破坏这一过程对研发新型抗癫痫药物阻止癫痫发作非常关键。Miro1介导的线粒体移动通过不断清除受损线粒体,将正常功能线粒体运输至作用部位,维持线粒体正常功能,对神经元发挥保护作用。因此癫痫发作过程中Miro1介导的线粒体移动有可能为临床上治疗癫痫提供新思路。Miro是线粒体外膜Rho GTPase家族的一员,它通过适配器蛋白(如Milton蛋白)与马达分子(如驱动蛋白Kinesin)相连接。果蝇中Milton蛋白是首先被确定的将Miro蛋白与马达分子链接的适配器蛋白。线粒体通过膜受体蛋白Miro连接适配器招募马达分子。这些马达分子/受体/适配器复合体确保目标线粒体的运输,精确调节它们的分配以应对神经元活动的改变。最新研究表明果蝇中Miro既调节轴突中线粒体的顺向运输,也调节逆向运输。果蝇中Miro突变损害线粒体运输至神经元远端区域,最终导致轴突和突触的线粒体消耗殆尽。神经元有丝分裂后期的细胞经历与机体相同的生命周期,当机体老化或者功能紊乱时需要线粒体不断移动至作用部位来补充能量。神经元发生应激反应或完整性受到破坏时线粒体会不断改变运动来保证神经元的正常活性。因此调节线粒体运输对满足新陈代谢需求的变化、移除老化及受损线粒体、补充正常功能线粒体至神经末梢至关重要。此次研究运用Sombati法,通过无镁细胞外液诱导海马神经元体外癫痫模型,并构建腺病毒真核表达质粒干预Miro1表达,通过免疫蛋白印迹等多种方法检测ND6、MDA及GSH表达水平的变化,探讨Miro1对致痫海马神经元氧化应激产生的影响,进一步明确能否通过调控线粒体移动发挥致痫神经元的保护作用。方法将出生24小时内的Sprague-Dawley大鼠,断头后剥离双侧大脑组织,然后置于磷酸盐缓冲液(PBS)培养皿中,剥离双侧海马组织,并制成单细胞悬液接种于培养板中进行原代培养。培养至14d的海马神经元随机分为对照组(CON)、无镁诱导组(AE)、AE+对照腺病毒转染组(AE+rAdv)、AE+靶向Miro1基因的shRNA重组腺病毒转染组(AE+rAd-Miro1-shRNA)。CON组与AE组分别用正常含镁细胞外液及无镁细胞外液培养3h后更换为维持液培养。AE+r Adv组、AE+rAd-Miro1-shRNA组于无镁诱导48h前分别转染不表达任何外源基因的对照腺病毒载体(rAdv)、靶向Miro1基因的shRNA重组腺病毒真核表达质粒(rAd-Miro1-shRNA),并于造模24h后终止细胞培养,用于后续实验。通过倒置相差显微镜观察海马神经元特征,神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色鉴定海马神经元纯度,采用Western blot法检测细胞内Miro1、ND6蛋白的表达,免疫荧光法检测细胞内ND6表达,比色法测定MDA、GSH的表达。结果神经元形态学特征倒置相差显微镜下观察到培养至7天时海马神经元体积变大,胞体成锥形,树突及轴突清晰可见,细胞之间具有紧密联系。神经元纯度测定神经元特异性烯醇化酶NSE染色鉴定,培养至7天时海马神经元纯度为90%以上。Miro1蛋白表达情况与CON组比较,AE组、AE+rAdv组Miro1表达升高,差异均具有统计学意义,P<0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA组Miro1表达降低,差异具有统计学意义,P<0.05。与AE组比较,AE+rAdv组Miro1表达升高,差异无统计学意义,P>0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA组Miro1表达降低,差异具有统计学意义,P<0.05。ND6蛋白表达情况(1)Western Blot法:与CON组比较,AE组、AE+rAdv组、AE+rAd-Miro1-shRNA组ND6表达降低,差异均具有统计学意义,P<0.05。与AE组比较,AE+rAdv组ND6表达降低,差异无统计学意义,P>0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA组ND6表达降低,差异具有统计学意义,P<0.05。(2)免疫荧光法:免疫荧光染色显示,细胞质呈红色荧光,细胞核呈蓝色荧光。运用ImageProPlus(IPP)图像处理分析软件分析,以累积光密度IOD(integrated optical density)作为胞质内ND6蛋白的相对表达量,其结果与Western Blot法检测ND6蛋白表达情况一致。MDA蛋白表达情况与CON组比较,AE组、AE+rAdv组、AE+rAd-Miro1-shRNA组MDA表达升高,差异均具有统计学意义,P<0.05。与AE组比较,AE+rAdv组MDA表达升高,差异无统计学意义,P>0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA组MDA表达升高,差异具有统计学意义,P<0.05。GSH蛋白表达情况与CON组比较,AE组、AE+rAdv组、AE+rAd-Miro1-shRNA组GSH表达降低,差异均具有统计学意义,P<0.05。与AE组比较,AE+rAdv组GSH表达降低,差异无统计学意义,P>0.05;AE+rAd-Miro1-shRNA组GSH表达降低,差异具有统计学意义,P<0.05。结论1.致痫神经元Miro1蛋白反应性升高,ND6蛋白降低,MDA蛋白升高,GSH蛋白降低,提示Miro1介导的线粒体移动参与癫痫病理过程,致痫后海马神经元产生氧化应激损伤。2.转染rAd-Miro1-shRNA病毒后,致痫神经元Miro1蛋白明显降低,ND6蛋白进一步降低,MDA蛋白进一步升高,GSH蛋白进一步降低,海马神经元氧化应激损伤加重,提示Miro1蛋白介导的线粒体移动对致痫海马神经元氧化应激损伤具有保护作用。3.通过提高线粒体移动减轻氧化应激损伤可能成为抗癫痫治疗的新前景。