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滞育是昆虫的一种生存策略,其能够使昆虫在不利环境中生存,例如寒冷的冬季、炎热的夏季等。昆虫滞育是一个生理过程,其主要的特征是生理上出现暂时性的停滞发育。近年来,昆虫滞育一直是研究者们的热门课题,主要从代谢生理、分子机制、遗传因素等多方面深入研究。海藻糖酶是昆虫滞育过程中一个重要的限速酶,其主要作用是催化海藻糖的分解,海藻糖作为昆虫的血糖,在滞育过程中发挥着重要作用。家蚕是重要的经济昆虫。前人在对家蚕滞育卵和非滞育卵产后32 h进行转录组测序,经分析发现,膜结合型海藻糖酶（BmTreh-2）基因在滞育卵和非滞育卵具有较大的差异表达。因此,本研究以二化性家蚕大造作为实验材料,通过对产后0-9 d滞育蚕卵和非滞育蚕卵进行生理指标测定、q PCR检测、western blot、免疫荧光定位、蚕卵干涉等方式,探究了家蚕滞育卵胚胎发育早期BmTreh-2基因的表达模式。获得的主要研究结果如下:（1）BmTreh-2基因生物信息学分析及部分基因序列的T克隆根据已有的转录组测序数据和NCBI等数据库比对得到了BmTreh-2基因CDS序列,主要的生物信息学预测结果是:BmTreh-2基因的ORF大小为1929 bp,编码642个氨基酸,蛋白分子量为73 k Da,等电点p I为5.65,不稳定指数为41.18,推测可能为不稳定蛋白,预测发现蛋白N末端具有一段18个氨基酸的信号肽,含有一段跨膜结构域,亲水性蛋白,第45-555个氨基酸片段为Trehalase功能结构域,故而该蛋白属于海藻糖家族。以大造3 d滞育卵的c DNA为克隆模板,成功得到了含有部分目的片段的T克隆重组载体。（2）家蚕BmTreh-2基因的原核表达、蛋白纯化浓缩及多克隆抗体制备选取家蚕BmTreh-2基因CDS序列中的一段非信号肽部分,在上下游引物中加入Bam HI和Xhol两个酶切位点,以T克隆重组质粒为模板进行PCR扩增,成功构建了含有双酶切位点的p ET-28a-BmTreh-2原核表达质粒,转入到BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞中扩大培养,并利用IPTG诱导蛋白表达,成功表达出一条分子量大小为35 k Da的蛋白,利用Ni柱亲和层析法将蛋白纯化浓缩后,制备了多克隆抗体,采用Elisa检测免疫抗体效价均超过1:50K,与重组抗原进行western blot后在35 k Da处有特异性识别且条带单一,抗体质量合格。（3）家蚕BmTreh-2基因在卵滞育胚胎发育早期的表达模式分析通过测定海藻糖酶活发现在滞育卵产后3 d内海藻糖酶活性较高,随后酶活性急剧下降至较低水平,非滞育卵在6 d点青后海藻糖酶活旺盛。海藻糖和糖原含量在滞育卵和非滞育卵产后逐渐下降。RT-PCR和q PCR检测蚕卵产后0-9 d海藻糖酶基因的表达水平,结果显示滞育组海藻糖酶基因的整体表达趋势是前期表达量很高,随着滞育的发生海藻糖酶基因的表达下调,且表达量非常低,随着滞育的加深,其表达量趋于稳定;非滞育卵产后海藻糖酶基因表达量较低,随着胚胎发育,在第7 d点青以后,海藻糖酶基因表达极高,一直持续到蚕卵孵化。Western Blot结果显示,在滞育卵3 d时BmTreh-2峰值表达随后下降,9 d几乎无表达,非滞育卵在产后基因呈逐渐上调趋势,一直持续到出蚁。石蜡切片和HE染色观察到滞育卵在2 d左右胚胎基本成形,随后形态基本无变化,且滞育卵中一直有丰富的卵黄颗粒;非滞育卵在产后胚胎不断地发育,在5 d时蚕体分节清晰可见,头胸分化明显,随着胚胎的不断生长,需要大量的营养代谢物质,所以卵黄颗粒逐渐被吸收,所以7 d点青后卵黄颗粒基本消失。免疫荧光定位结果显示,BmTreh-2蛋白在滞育卵的胚胎和卵黄中均有大量分布,且产后3 d荧光信号最强;非滞育卵的BmTreh-2蛋白主要集中在胚胎中。（4）家蚕滞育卵胚胎发育早期的糖代谢主要通路基因的表达研究通过测定滞育卵胚胎发育早期的海藻糖、葡萄糖、糖原、山梨醇的含量变化,发现在滞育卵中海藻糖和糖原含量均逐渐下降,山梨醇含量在滞育卵和非滞育卵产后均逐渐上升,葡萄糖含量在滞育卵产后2 d达到最高值,之后急速下降,在非滞育卵7 d陡增。利用q PCR技术检测了糖代谢的主要通路基因的m RNA水平,在滞育卵内与糖原分解相关的酶基因在产后2 d内表达水平较高,同时在2 d以后催化海藻糖向山梨醇转化的醛糖还原酶的表达量逐渐上调。利用RNAi技术将ds BmTreh-2注射进刚产下的滞育卵,48 h后检测发现BmTreh-2表达下调非常明显,而72 h后发现BmTreh-2恢复至正常水平,且BmTreh-2通路上的有关基因也发生了明显的改变。综上所述,本研究首先对蚕卵中的BmTreh-2基因进行了鉴定,并从生理指标、转录水平、蛋白水平等多方面,分析了家蚕BmTreh-2基因在家蚕滞育卵（非滞育卵作为对照组）产后胚胎发育早期的表达模式,同时采用RNAi技术对BmTreh-2基因进行干涉,并分析了BmTreh-2所在的糖代谢通路上的一些主要基因的表达变化,初步探究了家蚕BmTreh-2基因在滞育卵胚胎发育早期的功能及相关糖代谢途径中的功能。