单纯性马蹄内翻足遗传易感基因的定位与鉴定前言单纯性马蹄内翻足(idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV)是常见的严重危害儿童健康的先天畸形之一，主要表现为足前端内收，踝跖屈，跟骨内翻，胫骨远侧内旋等改变，发病率约为活婴的1～8‰，发病率在各种族间存在一定差异，在我国约为0.6‰～1‰，男女比例约为2.6：1，双侧发病者约占50.9％。ICTEV的病因是未知的，临床资料和流行病学研究表明，ICTEV主要是由于胚胎期遗传因素和环境因素共同作用，从而导致肢体发育异常。遗传因素在ICTEV的发病过程中发挥重要作用，遗传度为65％，但其遗传方式、外显率等均不清楚，易感基因尚未确定。所以，研究ICTEV的分子遗传学机制，不仅可为阐明ICTEV的发生机制和遗传学干预提供理论依据，而且可以为其它先天畸形的研究提供可借鉴的科学方法。肢体的发育是一个极其复杂的过程。它涉及胚胎发育过程中不同时间、不同空间的若干个基因先后表达，也涉及细胞的迁移、分化、增生及精确的相互作用。国外学者应用荧光原位杂交、免疫组化、基因剔除(gene knockout)等方法，通过对鸡胚、鼠等肢体发育的研究，发现了一些与肢体发育相关的基因，如DTDST、COL9A1、FGF、SHH、Wnt、EN-1、Lmx-1、7bx-4、Tbx-5、Pitx1、Hox、BMP等。这些基因为我们寻求ICTEV的相关基因提供了有利的线索。目前国内外关于单纯性马蹄内翻足的研究主要集中于孕早期环境因素和一些伴有足部畸形的综合征，发现了ICTEV可能的候选区域和候选基因：如5q15-31.1、17号染色体长臂远端、10p11.2-15、9号染色体中心粒周围区、DTDST等。但在单纯性ICTEV的研究方面，目前国内外在分子水平上的研究很少，还尚无明确的基因与ICTEV相关的报道。因此，对人类单纯性ICTEV发病机理的研究尚待深入。本课题组前期研究发现位于6q12-13区域内的D6S348位点与单纯性ICTEV显著相关(P<0.01)。提示在此位点附近可能存在单纯性ICTEV的遗传易感基因，为此我们在该位点附近选择了10个微卫星多态遗传标记：D6S965、D6S1681、D6S280、D6S1036、D6S493、D6S313、D6S239、D6S493、509-882F／509-882R、D6S1031，对84个核心家系252位成员进行基因型分析和传递不平衡检验(TransmissionDisequilibrium Test，TDT)，首次将单纯性马蹄内翻足遗传易感基因定位至6q12-13内的6.04cM，同时采用候选克隆策略，首次证明该候选区域内的COL9A1基因与单纯性ICTEV相关。材料与方法标本：84个ICTEV核心家系252名成员均来自中国医科大学第二临床学院小儿骨外科。所有患者均具有典型的临床表现，经X线检查及手术确诊。抽取患儿及其父母外周静脉血5ml，枸橼酸钠抗凝后-20℃冻存，备用。肌肉及肌腱标本来自于25例手术矫正的马蹄内翻足患儿，取外伤及尸检患儿相应组织作为正常对照，所有标本均经患者知情同意。马蹄内翻足大鼠模型来源于本课题组。一、微卫星多态位点的选择根据各个微卫星多态位点的等位基因数目、杂合度及多态信息含量(Polymorphic Information Content，PIC)值，选择染色体6q12-13区域内10个微卫星多态进行TDT检验。所有位点均选自基因组数据库(Genome Database，GDB)。二、基因型分析常规饱和氯化钠盐析法提取外周血DNA。PCR-STR方泫检测扩增片断，进行基因型分析。三、TDT检验和遗传多态分析对84个核心家系成员进行TDT检验。对有意义的微卫星多态位点在中国北方汉族人群中进行遗传多态分析。采用直接计数法计算各微卫星多态位点等位基因频率、基因型频率和杂合度。依据Hardy-Weinberg定律计算各微卫星多态位点基因型频率和杂合度预期值，采用x~2检验进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验。四、COL9A1基因与单纯性ICTEV相关性研究在COL9A1基因编码区选择2个可引起氨基酸改变的cSNP：rs592121与rs1135056。常规PCR扩增后，采用PCR-RFLP方法对84个单纯性ICTEV核心家系进行基因型分析。应用ETDT软件统计分析各SNP位点基因型与单纯性马蹄内翻足的相关性；应用TRANSMIT软件构建单体型并统计分析单体型频率是否存在差异；同时采用半定量RT-PCR及免疫组化方法检测马蹄内翻足模型鼠及25例马蹄内翻足患儿肌肉及肌腱组织COL9A1基因mRNA及蛋白水平的表达情况。五、COL9A1基因表达调控的初步研究PCR-SSCP方法进行COL9A1基因近端启动子突变筛查。构建COL9A1基因近端启动子及内含子荧光素酶报告基因载体990Luc及990LucInt，转染Bel、823及人成纤维细胞系，检测荧光素酶活性；构建COL9A1基因990bp各种截短型荧光素酶报告基因载体990Luc、704Luc、548Luc、162Luc、420Luc、336Luc、217Luc及157Luc，转染Bel、823及人成纤维细胞系，检测荧光素酶活性；应用P-Match软件在人类COL9A1基因转录起始点上游-275到-403和-275到-185位置分别预测了1个C／EBP转录因子及SOX9转录因子的结合位点，分别构建了COL9A1基因的M1、M2、M3、M4荧光素酶报告基因载体，转染Bel细胞系，检测荧光素酶活性，观察C／EBP及SOX9对COL9A1基因表达的作用。实验结果一、基因型分析结果D6S493位点只见一个等位基因，在分析时去除。84个核心家系在其余9个微卫星多态位点基因型分析结果符合孟德尔遗传。二、TDT检验结果D6S1036、D6S239、D6S421、D6S1681、509-882F／R、D6S280、D6S313等7个位点经TDT检验存在连锁不平衡(覆盖6q12-13区域，6.04cM)，P(0.05，与单纯性马蹄内翻足相关；而在D6S965及D6S1031位点未检测出连锁不平衡的存在，P＞0.05。三、遗传多态性分析结果100名无血缘关系个体在D6S1036、D6S239、D6S1681、D6S421、509-8B2F／R、D6S280和D6S313 7个微卫星多态位点分别检测到5、6、6、6、8、6、5个等位基因，12、18、19、14、27、19和10种基因型。x~2检验显示，各微卫星多态位点不同基因型个体数的观察值和预期值之间差异无显著性(P＞0.05)，表明该群体符合Hardy-Weinberg平衡。在D6S1036、D6S239、D6S1681、D6S421、509882F／R、D6S280和D6S3137个微卫星多态位点中，杂合度最高的是D6S1681及509-882F／R，为85％，杂合度最低的是D6S1036及D6S313，为77％，均具有较好的多态性。四、COL9A1基因PCR-RFLP结果Rs592121 PCR扩增产物为151bp，当等位基因为G时，PCR产物经HaeⅢ酶切后形成101bp和50bp片段；而等位基因为A时，PCR产物不能被切。Rs1135056PCR扩增产物为287bp，当等位基因为G时，PCR产物经SamⅠ酶切后形成160bp和127bp片段：而等位基因为A时，PCR产物不能被切。五、COL9A1基因测序和基因型分析结果COL9A1基因2个SNP不同基因型经测序证实。84个核心家系基因型分析结果符合孟德尔遗传。六、COL9A1基因与单纯性马蹄内翻足的相关性分析单位点关联分析结果显示：rs592121位点x~2=12.488，P＜0.05；rs1135056位点x~2=15.622，P＜0.05。rs592121及rs1135056均见有意义的关联。配对连锁不平衡检验表明rs592121与rs1135056之间存在连锁不平衡(D’=0.917065)。对存在连锁不平衡的rs592121和rs1135056进行单体型分析，共观察到4种基因型，但总体P＞0.05，无统计学意义。七、COL9A1基因在马蹄内翻足模型鼠及患儿组织中的表达半定量RT-PCR研究表明72.4％(21／29)的马蹄内翻足模型鼠中COL9A1基因表达上调，而正常胎鼠中未发现COL9A1基因表达上调。单纯性马蹄内翻足患儿肌肉及肌腱组织中COL9A1基因表达水平高于正常组织(t=4.7500，P＜0.05)。免疫组化结果与RT-PCR结果一致。结果表明COL9A1基因表达上调与先天性马蹄内翻足发生具有相关性。八、COL9A1基因近端启动子突变筛查结果应用PCR-SSCP方法对COL9A1基因近端启动子进行突变筛查，未发现突变。九、COL9A1基因表达调控的初步研究结果酶切和测序结果说明，COL9A1基因近端启动子990Luc及启动子内含子990LucInt荧光素酶报告基因载体构建成功，细胞转染实验表明：990Luc的启动子活性(以相对荧光素酶活性Ml／M2表示)为0.192，为pGL3-basic活性的480倍，表明我们克隆的COL9A1基因上游990bp片段具有较强的启动子活性。而990LucInt的相对荧光素酶活性为0.174，为pGL3-basic活性的435倍，与990Luc活性相差不多，说明第一内含子没有明显的转录调控活性；各种截短型荧光素酶报告基因载体转染结果表明：-559到-403之间、-275到-195之间可能存在着正调控元件，而在-403到-275之间可能存在着负调控元件。针对-275到-195及-403到-275之间设计的缺失型及突变型载体转染结果表明：SOX9的结合位点位于COLgA1基因近端启动子的-275～-257之间，可能是COL9A1基因的正调控元件。而C／EBP的结合位点位于COL9A1基因近端启动子的-321～-312之间，可能是COL9A1基因的负调控元件。结论(1)首次应用传递不平衡检验定位单纯性ICTEV遗传易感基因至6q12-13区域的6.04cM。(2)首次应用SNP关联分析、半定量RT-PCR及免疫组化方法证实COL9A1基因与单纯性ICTEV相关。(3)构建了pGL3-COL9A1荧光素酶报告基因载体。(4)在人类COL9A1基因转录起始点上游1000bp内鉴定了1个SOX9结合位点和1个C／EBP结合位点，并证实SOX9可能是COL9A1基因的正调控元件，而C／EBP可能是COL9A1基因的负调控元件。