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小G蛋白(SmallGTPases)是一系列大小为20～30KD,具有GTP酶活性的单体蛋白质。小G蛋白以结合GDP的无活性状态和结合GTP的活性状态发挥其重要的分子开关作用,参与调节细胞骨架结构、形态、极性、细胞黏附、迁移和细胞分化等多种生物学过程。RhoGTPases是小G蛋白家族成员,主要成员包括RhoA,Rac和Cdc42。本课题在细胞和动物两个水平探讨了小G蛋白家族的功能作用。第一部分,在细胞学水平,探讨了小G蛋白参与活化素B(ActivinB,ACTB)诱导骨髓间充质干细胞(Bonemesenchymalstemcells,BMSCs)迁移的信号机制。第二部分,针对课题组前期构建的表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠,应用高通量测序技术对基因敲除(Konckout,KO)小鼠和野生型(Wildtype,WT)小鼠的皮肤组织进行转录谱测序分析,探讨小G蛋白成员Cdc42在皮肤发育和屏障形成中的调控机制。第一部分小G蛋白调节骨髓间充质干细胞迁移的信号机制研究骨髓间充质干细胞(Bonemesenchymalstemcells,BMSCs)是参与创伤修复的重要种子细胞,在机体损伤组织的修复和再生中起着重要作用。在组织修复过程中,BMSCs首先从骨髓进入外周血循环,定向迁移到损伤组织部位,在损伤部位微环境的多种分子调控下通过分化成特定的细胞和分泌相关蛋白实现修复损伤组织的功能。BMSCs在体内的迁移过程受到多种信号机制的调节。活化素(Activin)是转化生长因子-β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)超家族成员,通过作用于活化素受体Ⅰ与活化素受体Ⅱ发挥生物学效应。在创伤愈合的过程中,Activin/TGF-β是趋化因子之一,可以通过调节细胞的趋化性迁移、增殖分化和细胞外基质合成与分泌参与创伤修复。课题组前期研究表明,ActivinB可以在体外诱导BMSCs迁移,促进皮肤的创伤愈合。小G蛋白,具有GTP酶活性,以结合GDP的无活性状态和结合GTP的活性状态在多种细胞反应中发挥重要的分子开关作用。Rho家族蛋白的典型成员,RhoA,Rac和Cdc42,在细胞骨架重组过程中发挥重要作用。最早利用Swiss3T3小鼠胚胎成纤维细胞的研究显示,Rho家族蛋白通过不同的方式调节肌动蛋白骨架重组:RhoA主要调节黏着斑的形成以及细胞后端突起物的收缩,Rac主要调节细胞片状伪足的形成,Cdc42主要诱导细胞肌动蛋白丝状伪足的形成以及把握细胞迁移的方向。肌动蛋白骨架重组在细胞迁移的过程中发挥重要作用。最近的研究显示,在不同诱导条件下,Rho家族蛋白可以通过不同方式调节BMSCs的迁移。溶血磷脂酸(LPA)可以抑制RhoA促进BMSCs迁移;TGFβ可以通过激活RhoA促进BMSCs迁移。然而,目前还不清楚ActivinB究竟通过何种信号机制调节BMSCs的迁移。LIMK和Cofilin是RhoGTPase调节肌动蛋白骨架变化的重要下游信号。LIM激酶(LIMkinase,LIMK)家族主要有两个成员:LIMK1和LIMK2,它们在细胞迁移过程中起着重要的作用,通过调节Cofilin家族蛋白的活性而影响肌动蛋白细胞骨架结构,对细胞形态、运动、黏附以及迁移都至关重要。LIMK对cofilin蛋白磷酸化与去磷酸化间的平衡进行微调节可能是影响细胞迁移的决定性因素。本课题探讨Rho家族蛋白的典型成员RhoA,Rac和Cdc42在ActivinB诱导的BMSCs迁移过程中作用及其相关下游信号机制。实验方法:全骨髓贴壁法培养BMSCs,取P3代进行各组实验。细胞长至90%时,血清饥饿24h,ActivinB处理30min、2h、4h和6h后,鬼笔环肽染色,观察不同时间点BMSCs细胞骨架变化情况。Pulldownassay检测ActivinB处理15min、30min和2h后BMSCs中RhoGTPase成员RhoA、Rac和Cdc42的GTP活化情况。利用RhoA显性负效突变体RhoA(N19)和组成型激活突变体RhoA(L63)慢病毒感染BMSCs,利用鬼笔环肽染色、transwell小室迁移、细胞划痕实验检测在RhoA抑制和持续激活的情况下,ActivinB是否仍然影响BMSCs的细胞骨架变化和细胞迁移。Westernblot检测ActivinB处理BMSCs各时间点中RhoA影响肌动蛋白的经典下游信号Rock、Limk和Cofilin的活化情况。利用Rock1的抑制剂Y-27632处理BMSCs,westernblot检测下游信号通路LIMK和Cofilin的活化情况,检测ActivinB是否通过Rock介导BMSCs中下游信号分子的活化。实验结果:1.ActivinB诱导BMSCs肌动蛋白骨架快速重组:ActivinB刺激2h,BMSCs肌动蛋白骨架开始重组,这种变化一直持续到刺激后6h。对照组中细胞的肌动蛋白骨架主要是皮层肌动蛋白,胞体内缺乏应激纤维。而ActivnB处理组的细胞则铺展开呈扇形,同时它们的肌动蛋白骨架也发生变化,在胞体内形成应激纤维。2.ActivinB诱导BMSCs后小G蛋白成员RhoA活化:Pulldown实验中,与Control组相比,ActivinB诱导15min和30min,RhoA活性显著增强(95%CI(1.45,1.90),(1.91,2.82))。然而Rac活性和Cdc42活性各时间点之间没有明显变化(F=0.297,P=0.754;F=0.129,P=0.882)。3.RhoA的激活对于ActicinB诱导的BMSCs肌动蛋白重组和细胞迁移是必须的:RhoA(N19)慢病毒感染的BMSCs在ActicinB诱导后不发生肌动蛋白骨架的变化。Transwell实验中,虽然下室仍有ActicinB诱导,但被RhoA(N19)慢病毒感染的BMSCs迁移至下层的细胞数少于对照组,而RhoA(L63)慢病毒感染的BMSCs迁移至下层的细胞数则多于对照组。细胞划痕实验中,不同时间点之间的划痕面积有显著性差异(F=945.706,P