呼吸道传染病具有病原种类多,人群普遍易感,传播性强,控制较难等特点。世界卫生组织(WHO)于2012年更新的全球人类死亡原因数据库中,呼吸道感染列第三位。然而目前常规病原学诊断技术滞后,难以满足临床需要,经验性抗感染治疗普遍存在。经验性治疗通常使用大量广谱抗生素导致耐药菌的产生同时也不利于新发传染病的治疗。因此要不断开发和完善更有效的检测手段。测序技术可通过核酸序列特异性对病原体直接检定,使得检测更加快速准确,能够有效地实现针对性治疗。本研究优化完善了前处理、提取及建库过程的各个关键技术要点。通过实验确定了痰液在进行核酸提取前需要通过5%二硫苏糖醇进行前处理,鼻咽拭子、脑脊液等样本可用Millipore超滤管进行浓缩,利用过滤法去除宿主核酸提高病原核酸比例,利用天根的微量样品基因组提取试剂盒可以用较低的成本达到较好的提取效果,在DNA建库时磁珠纯化量的最佳比例是末端修复后采用1.6倍体积磁珠纯化,接头连接后采用1.2倍体积磁珠纯化,利用磁珠对建库后DNA进行片段选择既节约成本又省时间。最后形成了一套从样本接收到报告发放的完整流程。实现了整个流程在48小时内完成。并且从敏感性、稳定性、特异性和准确性几方面验证了该技术的可行性和准确性。