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秸秆资源是世界上丰富的、可再生的生物质资源,其中富含碳、氮、磷、钾及矿物质元素,对改善土壤耕作性、增加有机质含量具有重要意义。但秸秆具有由纤维素、半纤维素、木质素等相互缠绕形成的致密结构,不易被降解利用。环保、有效的生物降解方法近年来备受关注,微生物分泌纤维素酶、半纤维素酶及木质素酶能有效降解秸秆中的主要成分,对提高秸秆的综合利用率发挥着重要的作用。本研究从盐碱土壤中分离筛选得到3株秸秆降解细菌,并对其秸秆降解发酵条件、秸秆降解能力、酶活特性及关键酶基因进行克隆及功能分析,具体研究结果如下:1.通过对6种土样中内切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、木聚糖酶(xylanase)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)的酶活比较分析,从各酶活较高的盐碱土、松树土、杨树土中分离筛选出3株秸秆降解菌yj1,yj2,yj3,经革兰氏染色及16SrDNA鉴定分别确定为假单胞菌属(G﹣)、芽孢杆菌属(G﹢)、短杆菌属(G﹢)。3株菌降解秸秆的最适培养温度及最适初始pH值分别为37℃、8;30℃、8;37℃、7。培养8天时秸秆降解率分别为:25.58%、26.61%、23.71%,且发酵液pH一直保持在8左右。说明本实验获得的3种秸秆降解菌具有一定的耐碱性,对玉米秸秆具有较强的降解能力,其中秸秆降解菌yj2的降解能力最强。2.秸秆降解需要多种纤维素降解酶共同参与。以CMCNa为碳源时,yj2的EG、BG及xylanase酶活最高值分别为37.34U、266.89U、516.08U,而yj1、yj3无xylanase酶活,且EG、BG酶活仅为2.34U、2.23U。以秸秆为碳源时,yj2的EG、BG、xylanase、LiP、MnP、Lac的酶活相较于yj1、yj3均较高,6种酶共同作用降解秸秆,而yj1、yj3没有xylanase,主要依靠LiP、MnP、Lac降解秸秆。因此推断菌株yj2降解效果好主要由xylanase发挥作用。3.以CMCNa、秸秆为碳源的条件下,菌株yj2的EG、BG、xylanase三个基因表达量均表现为24h高于12h,EG、BG、xylanase基因表达量与酶活变化趋势一致。4.对3株菌的酶活分析可知,xylanase对秸秆降解具有重要作用,克隆得到该基因,命名为xylanase,大小为642bp,与NCBI提交木聚糖酶基因序列相似度均达95%以上。通过生物信息学分析表明,克隆得到的木聚糖酶属于糖基水解酶家族11(GH11),是一种带信号肽的、亲水的碱性胞外分泌蛋白。将xylanase基因与表达载体pET-30a连接,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,经SDS-PAGE蛋白电泳检测其融合蛋白大小为28 KDa。利用DNS法测定木聚糖酶酶活,BL21(pET-30a-xylanase)菌株xylanase酶活24 h内随时间的增加而增加,在24 h时酶活达到最大为387.26U,酶活的变化呈显著性差异。本研究还克隆得到内切葡聚糖酶基因,命名为EG,大小为1500bp。通过生物信息学分析可知属于糖基水解酶家族5(GH5),同时还含有碳水化合物结合域3(CBM3),同样为带信号肽的、亲水的碱性胞外分泌蛋白。