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自然界中重金属镉是最危险的污染物之一。镉中毒会引起肺水肿、急性肝炎、睾丸损伤、肾中毒、免疫毒性甚至致死。传统的物理化学方法检测到的是环境中重金属镉的总含量,无法反映出重金属镉的生物毒性效应,而生物检测方法不仅能反映出镉的生物毒性效应,更能表征镉对环境的实际污染程度。本课题的目的是构建一种特异性检测环境中重金属镉的工程菌株来应用于环境中镉的检测。研究方法:以俄罗斯I.M.Solovieva教授惠赠的质粒pPCadA为模板利用聚合酶链式反应(PCR)扩增出镉启动子基因PcadA (并在其上下游分别引入EcoRI和BamHI的酶切位点),扩增出来的片段即为特异性镉启动子片段,经EcoRI和BamHI双酶切,并通过胶回收试剂盒纯化。目的基因来源于本课题组构建的重组质粒pMD20-T-luxCDABE,以重组质粒pMD20-T-luxCDABE为模板,利用PCR技术扩增出细菌荧光素酶基因luxCDABE (并在其上下游分别引入BamHI和HindIII的酶切位点),即为目的基因片段,经BamHI和HindIII双酶切,可以得到双粘性末端,酶切产物回收后克隆到同样用BamHI/HindIII双酶切的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌的穿梭载体质粒pNW33N上,重组质粒命名为pNW33N- luxCDABE。将扩增出来的镉启动子PcadA克隆到同样用EcoRI和BamHI酶切的重组质粒pNW33N- luxCDABE,即得到含镉启动子的细菌荧光素酶基因的重组体pPcadA- luxCDABE。将重组体转化到枯草芽孢杆菌1A751中并在含氯霉素的LB培养基上选择性生长,生长出的单菌落,扩增后进行质粒的小量快速提取,并对其进行单、双酶切鉴定及PCR鉴定。最后检测重组工程菌对镉的灵敏性及特异性。实验结果:镉启动子基因PcadA和荧光素酶基因luxCDABE扩增成功,经酶切及PCR的鉴定已成功构建出重组质粒pPcadA和pNW33N-luxCDABE,为成功构建特异性检测重金属镉的重组质粒pPcadA-luxCDABE打下基础。