心肌梗死后大量心肌细胞死亡、细胞外基质降解、心室重构并最终导致心力衰竭的发生,严重影响患者的生存时间和生活质量,给社会及家庭带来沉重负担,目前尚缺乏有效预防策略。干细胞移植是一种极具前景的治疗手段。骨髓间充质干细胞以其取材方便、培养与扩增简单、移植后不增加恶性心律失常的风险,并且不具有免疫原性而占有独特优势。但移植后干细胞在心肌内的存留率非常低,同时恶劣的局部微环境亦使得存留的干细胞很难长期生存,无法取得良好的临床效果。结合心肌梗死后心室重构的病理生理过程,众多学者尝试在心肌梗死区补充细胞外基质的类似物水凝胶,阻断心室重构过程,取得了良好的治疗效果。前期研究表明采用温度敏感性水凝胶携带骨髓干细胞原位移植能提高局部移植细胞的存留率,保护心肌梗死后心功能,抑制心室重构。但对于温度敏感性水凝胶注射抑制心肌梗死后心室重构的机制、注射时间是否会影响治疗效果、温度敏感性水凝胶是否能提供良好的微环境从而放宽干细胞移植的时间窗等尚未阐明。研究目的：1.建立大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定及三维培养方法；2.建立大鼠心肌梗死模型和心功能评价方法；3.探讨注射时间对温度敏感性水凝胶抑制心肌梗死后心室重构的影响及温度敏感性水凝胶抑制心肌梗死后心室重构的可能机制；4.探讨温度敏感性水凝胶对心肌梗死后骨髓间充质干细胞原位移植时间窗的影响及其可能机制。研究方法：本文的研究内容主要包括以下四部分：第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及三维培养。提取4周龄Wistar大鼠四肢长骨骨髓,通过全骨髓贴壁法体外培养、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态及增殖特性,通过流式细胞仪鉴定CD34、CD29的表达,通过成脂诱导、成骨诱导对其分化能力进行鉴定,并用不同浓度的温度敏感性水凝胶进行三维培养,扫描电镜下观察水凝胶的空间结构及细胞三维培养情况,为下一步实验做准备。第二部分：大鼠心肌梗死模型制作及心功能评价。选用雄性Wistar大鼠作为实验动物,通过结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。28天后,通过超声心动图、血流动力学评价大鼠心功能,并通过超声心动图、HE染色及Masson三色染色评价心肌梗死大鼠左室重构情况。第三部分：注射时间对温度敏感性水凝胶抑制心肌梗死后心室重构的影响。分别于结扎冠状动脉左前降支后2小时、7天、14天将温度敏感性DPHP水凝胶注射于大鼠梗死周边区,以PBS作为对照,梗死28天后通过超声心动图、血流动力学评价大鼠心功能；通过超声心动图、HE染色、Masson三色染色评价心肌梗死大鼠左室扩张、瘢痕扩展、室壁变薄等左室重构情况；通过Masson三色染色评价心室胶原重构情况；通过α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)免疫组织化学染色评价梗死区新生血管形成情况。第四部分：温度敏感性水凝胶对心肌梗死后骨髓间充质干细胞原位移植时间窗的影响。分别于结扎冠状动脉左前降支后7天、14天,将温度敏感性水凝胶携带骨髓间充质干细胞注射于大鼠梗死周边区,以PBS携带骨髓间充质干细胞作为对照,24小时后冰冻切片观察细胞存留率；梗死28天后通过超声心动图、血流动力学评价大鼠心功能；通过超声心动图、HE染色、Masson三色染色评价心肌梗死大鼠左室扩张、瘢痕扩展、室壁变薄等左室重构情况；通过Masson三色染色评价心室胶原重构情况；通过α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)免疫组织化学染色评价梗死区新生血管形成情况。研究结果：第一部分：从4周龄大鼠四肢长骨中提取的骨髓经贴壁法培养1天后,细胞贴壁生长,由均一单个圆形逐渐呈长条形、梭形或形成“触角”样分叉,培养6-9天后,细胞可达85%融合,部分细胞呈集落样生长,经胰酶消化纯化后,到第三代可得到较为纯化的骨髓间充质干细胞,流式细胞术检测细胞表面抗体CD29阳性率98.1%,CD34表达阴性。分化鉴定表明骨髓间充质干细胞经诱导后油红O染色、ALP染色阳性,表明其可向脂肪细胞、成骨细胞分化。骨髓间充质干细胞经DAPI染色有强蓝色荧光反应。分别用0.25%、0.5%、1%、2%的温度敏感水凝胶进行骨髓间充质干细胞三维培养,结果显示0.25%很难成胶；0.5%成胶不稳定,扫描电镜下孔径大小不一；1%、2%可稳定成胶,扫描电镜显示1%、2%水凝胶孔径均一,其中1%水凝胶呈蜂窝状,孔壁较薄,与人类心脏结缔组织骨架结构相似,细胞与水凝胶贴合较好,细胞数量多；2%水凝胶孔壁较厚,细胞与水凝胶贴合不如1%水凝胶,细胞数量较1%水凝胶少。第二部分：结扎冠状动脉左前降支后,可见结扎线以下左心室前壁及侧壁颜色变白,心电图提示Ⅱ,Ⅲ,aVF导联ST段弓背向上抬高。4周后,与假手术组相比,急性心肌梗死组大鼠梗死壁变薄,室壁运动减弱,心腔扩大(LVESV、LVESD、LVEDV、LVEDD增加),心功能下降(EF、FS、LVESP、±dp/dtmax明显降低)。病理学切片结果显示急性心肌梗死组大鼠室壁变薄,心腔扩大,心肌细胞坏死,代之以大量纤维结缔组织。第三部分：初步分析结果表明,与PBS组相比,2小时、14天温度敏感性水凝胶注射组大鼠心肌梗死后心功能得到显著改善,7天温度敏感性水凝胶注射组改善不如前两组明显；各时间点水凝胶注射组大鼠梗死壁厚度增加,未见明显新生血管形成。第四部分：初步分析结果表明,与PBS/Cell组相比,应用温度敏感性水凝胶携带骨髓间充质干细胞原位移植于心肌梗死后7天、14天的大鼠心脏梗死周边区,可保护大鼠心功能,抑制梗死后心室重构。由于样本量小,两组血流动力学及超声心动图结果非常接近,尚难判断哪组治疗效果更好。研究结论：本研究成功建立了大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定方法,采用温度敏感性水凝胶进行三维培养,结果表明1%的水凝胶最适合细胞生长。以大鼠为实验动物,成功复制了透壁性心肌梗死模型,并成功建立了心肌梗死后大鼠心功能及心室重构的评价方法。初步研究结果表明,各时间点于梗死周边区注射温度敏感性水凝胶,治疗效果以2小时最佳,14天其次,7天组与PBS注射组相比心功能无明显改善(可能与样本量太小有关),需进一步补充实验；心肌梗死后7天、14天,将温度敏感性水凝胶携带的骨髓间充质干细胞移植于梗死周边区,可保护大鼠心功能,抑制心室重构,温度敏感性水凝胶的应用可放宽心肌梗死后骨髓间充质干细胞移植时间窗。造成该治疗效果差异的原因及温度敏感性水凝胶影响心肌梗死后骨髓间充质干细胞原位移植时间窗的机制有待进一步探讨。