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目的:1、建立吉非替尼稳定耐药的人非小细胞肺腺癌A549/GR细胞株;2、探讨胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)及其下游信号分子磷酸化蛋白激酶B1(p-AKT1)与肺腺癌A549细胞发生吉非替尼获得性耐药之间的关系;3、高表达耐药细胞内的微小RNA-497(mi R-497)后,探讨非小细胞肺癌中miR-497作用于IGF-1R信号通路对吉非替尼获得性耐药的影响。方法:1、体外无菌环境下培养非小细胞肺癌A549亲本细胞株,并通过低浓度药物逐步加量诱导的方法,建立吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株A549/GR;2、倒置显微镜下观察自然生长状态下及HE染色后耐药细胞株A549/GR形态学的变化,MTT实验测定不同药物浓度作用下A549及A549/GR细胞株的细胞活力,确定A549/GR细胞株对吉非替尼的耐药程度;3、蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测亲本株A549及耐药株A549/GR细胞中IGF-1R蛋白及其下游p-AKT1的表达情况;4、以耐药细胞株A549/GR为模型,运用RiboFECTTMCP转染试剂介导mi R-497 mimic进行瞬时转染,高表达细胞内的miR497,荧光显微镜下观察转染情况;5、MTT实验测定转染前后耐药细胞对吉非替尼耐药性的改变;6、Western blot法检测转染前后耐药细胞中IGF-1R蛋白及其下游信号分子p-AKT1的表达情况。结果:1、吉非替尼诱导培养10个月后,建立的耐药株A549/GR细胞可在40μmol/L吉非替尼浓度的培养基中稳定生长;2、倒置显微镜下观察亲本株A549及耐药株A549/GR均为贴壁细胞,细胞大小不一,A549细胞形态主要为多边形,而耐药株A549/GR细胞形态多为纺锤状,且核分裂现象较亲本株明显;3、MTT法测得A549细胞株半数抑制药物浓度为(8.90±0.48)μmol/L,A549/GR细胞株半数抑制药物浓度为(51.96±2.39)μmol/L(p<0.01),耐药指数为5.84;4、Western Blot实验显示,A549/GR细胞中IGF-1R蛋白表达水平较A549细胞升高(p<0.05),且p-AKT1的表达量增加(p<0.05);5、耐药细胞株A549/GR转染miR-497 mimic后荧光显微镜下观察,转染效果良好(如图4示);6、MTT法显示转染后细胞株A549/GR-miR497-mimic半数抑制药物浓度为(33.76±0.97)μmol/L,是阴性对照组的0.65倍(p<0.01);7、Western blot实验测得mi R-497高表达后的耐药细胞株A549/GR-miR497-mimic中IGF-1R及p-AKT1蛋白表达水平均低于阴性对照组(p<0.05)。结论:1.成功建立对吉非替尼稳定耐药的非小细胞肺癌A549/GR细胞株,且其细胞的形态改变与耐药性的相符;2.在耐药细胞株A549/GR中,IGF-1R蛋白及其下游信号分子p-AKT1的表达量较亲本细胞株增高,表明IGF-1R及其下游AKT1信号转导通路的活化可促进非小细胞肺癌细胞对吉非替尼获得性耐药;3.在耐药细胞株A549/GR中高表达miR-497后,耐药细胞对吉非替尼的耐药性降低,推测高表达miR-497后可以提高A549/GR耐药细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKIs)的敏感性;4、在耐药细胞株A549/GR中高表达miR-497后,IGF-1R及p-AKT1蛋白的表达量较阴性对照组降低,推断高表达的miR-497可抑制IGF-1R蛋白表达,进而阻碍IGF-1R下游蛋白激酶B1(AKT1)信号的磷酸化活化,并最终提高吉非替尼耐药的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞对EGFR-TKIs靶向治疗药物的敏感性。