目前异性间性传播已成为艾滋病传播的主要途径。杀微生物剂是一种可被女性控制的有效避免HIV感染的手段之一。但是,迄今为止尚无杀微生物剂类药物问世,7个已完成Ⅱ/Ⅲ期临床试验的候选杀微生物剂的研究结果均令人失望。这些杀微生物剂临床试验失败的原因是什么呢?由于杀微生物剂用药部位为阴道,其药效不能忽视精液对杀微生物剂的影响。2007年,德国Ulm大学Munch J等人研究发现,精液中存在的前列腺酸性磷酸酶多肽片段(PAP248-286)能形成淀粉样纤维,促进HIV的感染。这一多肽形成的淀粉样纤维称为精液源性病毒感染增强因子,即SEVI。研究证实,SEVI促进HIV病毒感染可能的作用机理主要是其形成的淀粉样纤维具有极强的阳离子特性,能通过两种方式增强HIV感染：1)降低HIV病毒颗粒与靶细胞之间的静电排斥；2)捕获HIV病毒颗粒并增加病毒在靶细胞表面的沉降,有助于病毒与宿主细胞相互作用,从而增加病毒颗粒与靶细胞之间的吸附。此后又有研究发现精液中含有其他淀粉样纤维增强HIV感染,第一个是N末端的PAP85-120,第二个是,2011年,Roan NR等人发现的精液液化功能最密切的生精蛋白即精液凝固蛋白(SEM)的生理性降解多肽。SEVI或SEM1在体外形成淀粉样纤维的条件比较苛刻,一般需要在37℃,1400 rpm,持续震荡一定时间,才能形成稳定成熟的淀粉样纤维。我们的前期研究发现,SEVI极有可能是导致多聚阴离子类杀微生物剂临床试验失败的主要原因。我们之前研究发现,衍生于HIV-1 MN毒株包膜蛋白gp120的多肽能拮抗融合抑制剂T-20的抗病毒活性,当时推测T-20能特异与gp120辅助受体结合区和gp41跨膜区结合,因而具有多靶点的抗HIV融合的机制。然而在深入研究T-20的作用机制时,我们并没有发现T-20与来源于gp120辅助受体结合区域和gp41跨膜区多肽存在预期的相互作用。但是,我们近期研究发现,这些衍生多肽,如多肽EP2,无需上述SEVI及SEM1要求的苛刻条件就可以自发形成淀粉样纤维,且该类衍生多肽能明显促进SEVI及SEM1(86-107)淀粉样纤维的形成,大大缩短SEVI及SEM1(86-107)淀粉样纤维形成的时间。根据文献报道,采用正常HIV-1病毒包膜蛋白gp120攻击大鼠后,其肝细胞裂解液中能检测出gp120的裂解片段(INMWQG),我们发现该片段与本项目研究的HIVgp120衍生多肽中的一段序列EP2具有高度重复性,据此我们推测该裂解片段也极有可能促进SEVI的形成进而增强HIV-1感染。EP2片段在体内是否存在目前研究尚未可知,但该段短肽(INMWQG)已经证实是真实存在在大鼠体内的gp120降解片段。为了更好地研发理想的候选杀微生物剂,我们拟对SEVI及其它能形成淀粉样纤维的多肽类物质(如SEM1(86-107))促进HIV感染的机制进行研究。上述HIV gp120的衍生多肽是否作为一个种核(seed),促进精液淀粉样纤维的形成?这是否也是导致杀微生物剂临床试验失败的原因之一呢?SEVI的发现不仅可以作为未来候选杀微生物剂研发的重要评价指标之一,同时也为艾滋病防治药物的开发提供了一个新的作用靶点。利用药物阻断SEVI与病毒颗粒结合或抑制SEVI淀粉样纤维的形成,理论上可降低SEVI介导的增强病毒感染作用,从而降低HIV的感染率。理论上,抗SEVI抗体能够通过其抗体功能区与SEVI多肽特异性结合,从而拮抗SEVI增强病毒感染的作用,课题组前期研究也证实了这一假设,但抗SEVI抗体自身几乎没有抗病毒活性。NeurathAR和姜世勃等人研究发现：经不同酸酐修饰的一些蛋白,能抑制HIV病毒进入靶细胞,使无活性的蛋白产生抗HIV活性。近年来,本课题组选用卵清蛋白(Ovabumin, OVA)和人血清白蛋白,制备了酸酐修饰卵清蛋白HP-OVA及酸酐修饰人血清白蛋白HP-HSA,均能高效抑制多种HIV病毒株的感染,其机理是干扰gp120与CD4受体的相互作用,从而抑制HIV进入靶细胞。既然酸酐修饰能使不具有抗HIV活性的OVA及其它多种蛋白质变成高效抗HIV活性的蛋白分子,如果能我们针对兔抗SEVI多抗进行酸酐修饰,也有望提高其自身的抗HIV活性。我们前期也曾制备一种兔抗HIV-1 gp41多克隆抗体(NY363,姜世勃教授发现的一种能特异性识别HIV-1 gp41 N及C末端肽形成的六螺旋结构的多克隆抗体),发现酸酐修饰能显著提高该抗体的抗病毒活性,且能部分保持其抗体功能区活性。因而,采用酸酐修饰的抗SEVI多抗,就有可能成为一种既能保持抗体功能区活性从而拮抗SEVI增强病毒感染作用,其本身又具有高抗HIV活性的双功能候选杀微生物剂,从而最大程度地避免未来临床试验时因精液中SEVI的存在而导致失败的可能性。这种酸酐修饰抗SEVI多抗可望解决目前阴离子多聚物类杀微生物剂研发面临的困难,成为一种理想的杀微生物剂。因此本课题拟进行以下两部分内容的探讨：第一部分衍生于HIV-1 gp120的多肽促进SEVI淀粉样纤维形成的作用及机制研究。目的：拟采用一系列生物物理及生物化学手段,深入探讨这些衍生于HIV包膜蛋白gp120的衍生多肽EP2与SEVI及SEM1(86-107)的淀粉样纤维形成的相互作用和作用机制,分析EP2促进SEVI及SEM1(86-107)形成从而增强病毒感染的机理。同时研究短肽INMWQG(简称为SEMA)能否增强HIV感染及促进SEVI,SEM1(86-107)淀粉样纤维的形成,该研究为临床杀微生物剂和抗HIV药物研发提供理论依据。方法与结果采用Zetasizer Nano ZS仪器测定EP2的粒径和Zeta电势,ThT荧光测定方法,透射电镜法,我们发现来源于HIV gp120的衍生多肽EP2能自组装形成类纳米纤维。透射电镜法,硫磺素T荧光检测方法,刚果红染色法,圆二色谱法,我们确定EP2显著促进PAP248-286多肽形成SEVI淀粉样纤维,经EP2加速形成的SEVI保持其淀粉样纤维形态。用激光共聚焦显微镜法和流式细胞术,确定EP2加速后形成的SEVI能促进HIV-1病毒颗粒聚集并增强其与靶细胞的结合。采用假病毒和克隆病毒感染实验,我们证实了经EP2加速形成的SEVI保持其增强HIV感染的能力。类似研究EP2加速SEVI形成方法,采用Zetasizer Nano ZS仪器测定SEMA的粒径和Zeta电势,ThT荧光测定方法,透射电镜法,我们发现SEMA能自组装形成淀粉样纤维,通过克隆病毒感染实验和流式细胞术,确定SEMA增强HIV-1感染能力。激光共聚焦显微镜法直观观察了SEMA促进HIV-1病毒颗粒聚集或增强HIV病毒颗粒与靶细胞的结合。接着,我们考察SEMA是否加速SEVI或SEM1(86-107)淀粉样纤维形成的能力。通过硫磺素T荧光检测方法,刚果红染色法,我们发现SEMA显著促进PAP248-286或SEM1(86-107)多肽形成淀粉样纤维,同时用克隆病毒感染实验,证实了经SEMA加速形成的SEVI或SEM1(86-107)淀粉样纤维保持其增强HIV感染的能力。结论1.来自HIV-1 gp120包膜EP2能自组装成纳米纤维并促进精液源性淀粉样纤维如SEVI的形成；2.正常HIV-1病毒包膜蛋白gp120攻击大鼠肝细胞后,其肝细胞裂解液中能检测出的gp120的裂解片段(INMWQG),能增强HIV-1感染,并促进精液源性淀粉样纤维如SEVI, SEMI(86-107)的形成。第二部分 酸酐修饰的兔抗SEVI多克隆抗体IgG (HP-API)作为双功能杀微生物剂研究。我们的前期研究证明,兔抗SEVI多克隆抗体能特异性地与SEVI多肽结合,从而产生拮抗SEVI增强病毒感染的作用,但其自身抗HIV病毒活性不强。酸酐修饰蛋白可以使不具有抗HIV活性的OVA变成高抗HIV活性的蛋白分子HP-OVA及ML-OVA。为此,本项目拟以SEVI为药物作用靶点,采用酸酐修饰方法制备酸酐修饰抗SEVI多抗,研发一种既具有高效抗HIV活性又具有拮抗SEVI病毒增强作用的双功能候选杀微生物剂。进一步采用一系列生物物理及生物化学手段,深入探讨该酸酐修饰抗SEVI抗体与精液及SEVI多肽PAP248-286的相互作用,以评价其是否能通过与SEVI多肽特异性地结合而拮抗SEVI增强HIV感染的作用,从而最大程度地避免未来临床试验失败的可能性。同时,深入分析酸酐修饰抗SEVI抗体阻止SEVI增强HIV感染的可能的机制和可能的引起毒性反应,为后续的药物研发提供理论依据。方法与结果ELISA及Western Blot检测发现,HP-API保持了API的大部分的抗体特性,能与多肽片段PAP248-286抗原及PAP248-286震荡形成的淀粉样纤维SEVI结合。HP-API本身有具有高抗HIV活性,能对抗多种HIV-1实验室及临床分离株的感染,其IC50均较低。同时,发现HP-API还能有效抑制各种抗病毒药物耐药病毒株的感染。通过time-of-addition、细胞与细胞融合、病毒与细胞融合及病毒细胞与细胞间的传播等实验说明：HP-API作用于HIV病毒的进入阶段,是一种HIV病毒进入/融合抑制剂,HP-API不抑制HIV病毒感染靶细胞后期的复制过程。ELISA和流式细胞仪实验结果说明,HP-API可以通过与HIV包膜糖蛋白或病毒作用靶细胞上的CD4分子结合,干扰包膜糖蛋白与CD4分子的结合,从而抑制病毒与靶细胞膜的融合,阻止HIV病毒的进入。理想的杀微生物剂必须具备高效,人体安全无毒的特点。为此,我们评估了HP-API对病毒作用靶细胞和对正常人阴道的细胞毒性,包括了MT-2, U87-CD4-CXCR4细胞和U87-CD4-CCR5细胞。我们发现HP-API对各靶细胞的细胞毒性作用均较低。进一步分析其机制,我们发现HP-API能显著抑制SEVI增强病毒感染作用,而本身的抗病毒活性基本保持不变,而阴性对照抗体API无任何抗病毒活性(IC50>75μg/ml)。SEVI沉淀部分的增强病毒感染活性较强,与SEVI的混合物较为相似,HP-API能显著抑制SEVI淀粉样纤维增强HIV-1感染的能力。但SEVI的上清部分增强病毒感染的活性较弱,基本与PBS相似,HP-API或API与PAP248-286多肽能特异性结合,肝素并不能拮抗HP-API或API与PAP248-286结合,说明HP-API及API与PAP248-286的结合的确是抗原抗体之间的特异性结合。采用刚果红溶液及硫磺素T,透射电子显微镜,圆二色谱法等方法,我们发现HP-API或API能浓度依赖性地抑制PAP248-286多肽形成淀粉样纤维,我们进一步采用硫磺素T(ThT)法检测HP-API及API对已经形成的成熟的SEVI淀粉样纤维的分解作用发现,HP-API及API均不能降解已经形成的SEVI淀粉样纤维,说明两者均在淀粉样纤维聚集过程中起抑制作用,而对淀粉样纤维无分解作用,我们采用荧光共聚焦显微镜,病毒pull-down方法检测SEVI或精液促进HIV-1病毒颗粒聚集,发现这种聚集能被HP-API抑制。结论3-羟基-邻苯二甲酸酐修饰抗SEVI抗体(HP-API)是阻止病毒进入和与SEVI淀粉样原纤维结合的广谱HIV进入／融合抑制剂。HP-API可以对抗艾滋病病毒SEVI淀粉样原纤维增强效果,同时抑制病毒感染,因此其具有较大的潜能被发展成预防HIV性传播的候选杀微生物剂。1. HP-API具有容易制备、低细胞毒性和生产成本低的特点,有广谱的抗病毒活性,可以抗各种HIV-1实验室病毒株及临床分离株的感染,甚至还可以抑制几种临床常用的抗病毒药物的耐药株的感染；2.研究HP-API的作用机制发现,HP-API是通过与HIV病毒包膜糖蛋白或病毒作用靶细胞的CD4分子结合,干扰病毒包膜糖蛋白与CD4分子的结合,从而抑制病毒与靶细胞膜的融合,阻止HIV病毒的进入。HP-API结合PAP248-286或SEVI能力很强,该特异性结合不受高负电荷的肝素影响,HP-API在体外抑制PAP248-286形成SEVI淀粉样纤维,进而阻断SEVI淀粉样纤维的增强HIV感染作用,对已形成的SEVI淀粉样纤维,没有分解淀粉样纤维的作用。通过有效的阻断SEVI与HIV-1颗粒结合,HP-API可以抑制SEVI-介导HIV-1感染增强。