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目的:肾脏纤维化是一种病理改变,是肾脏的功能由健康到损伤,再到损坏,直至功能丧失的渐进过程。肾脏纤维化包括肾小管间质纤维化和肾小球硬化,其主要病理表现为固有细胞受损,发展到后期出现大量胶原沉积和积聚,造成肾实质逐渐硬化,形成瘢痕,直至肾脏功能完全丧失。肾脏内固有细胞纤维化、硬化的过程也就是肾脏纤维化的过程。肾脏纤维化是慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的共同病理特征。目前,我国CKD的患病率约为10.8%,相当一部分人会进展到终末期肾病,需要进行肾脏替代治疗,给国家造成了巨大的经济和社会负担。而肾脏纤维化作为终末期肾脏疾病的主要病理表现,目前仍缺乏有效地治疗手段,这就需要我们积极探索,努力寻找纤维化发生发展过程中可能存在的机制,寻找可能的延缓甚至逆转纤维化的病理生理过程,为肾脏疾病的治疗提供新的治疗方法。环状RNA（Circular RNA,circ RNA）是一类特殊的非编码的RNA分子,也是目前RNA领域研究的热点。与传统的线性RAN分子不同,circ RNA是一类具有闭合环状结构的RNA分子,通过线性RNA的反向剪切,去除了5’端帽子和3’端多聚腺苷尾部结构,不受RNA外切酶影响,表达更稳定且不易降解,已被证明广泛存在于多种真核生物体内,具有重要的生物学功能。近年的研究表明,通过与疾病关联的微小RNA（micro RNA,miRNA,miR）相互作用,circ RNA在疾病中发挥着重要的调控作用。在生理水平上,内源性的circ RNAs通过与miRNAs结合,发挥“海绵”作用,抑制miRNAs功能的表达,此外circ RNA还参与调控基因的转录,调控蛋白的翻译以及作为生物标记物进行研究。本课题组此前主要进行circ RNA和miR的研究,积累了丰富的经验,同时,circHIPK3在心脏及肺部纤维化疾病中表达明显升高,且通过海绵不同的miR发挥着重要的作用,但其在肾脏纤维化疾病中如何表达,我们不得而知。为了进一步探讨circ RNA在慢性肾脏纤维化中发生发展的过程,我们进行了如下研究。本文旨在探讨circHIPK3在慢性间质性肾炎（Chronic tubulointerstitial nephritis,cTIN）中的表达情况,过表达circHIPK3后纤维化指标是否进一步加重,纤维化因素刺激肾小管上皮细胞后circHIPK3是否增多,并通过那种miR发挥重要作用,探索circHIPK3是否能成为肾脏纤维化治疗的新靶点。方法:首先选取人肾穿刺病理诊断为cTIN石蜡切片,癌旁大于5 cm肾组织作为正常对照,荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）方法进行circHIPK3、miR-30a的表达与定位,免疫荧光检测前纤维化蛋白转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1,TGF-β1）、纤连蛋白（Fibronectin,FN）、胶原蛋白1（Collagen 1,COL1）指标的表达。半定量分析上述指标的相关性。进一步选取16周的C57BL/6J鼠,按照250 mg/kg腹腔注射叶酸,对照组注射等体积的碳酸氢钠,每日观察小鼠的习性,30天后收集血清及肾组织标本（n=6）,收集的血清用于检测肌酐,尿素氮,肾组织一部分用于做石蜡切片PAS（Periodic Acid-Schiff）和MASSON染色,确认肾脏纤维化的发生。另外的小鼠肾组织可提取组织RNA,检测肾脏中circHIPK3、miR-30a、TGF-β1、FN、COL1的表达。提取组织蛋白,Western blot进一步确认TGF-β1、FN、COL1的表达情况,并判断circHIPK3、miR-30a与TGF-β1的相关性。最后,在人肾小管上皮细胞（HK-2）中,应用质粒转染的方法,使circHIPK3过表达,检测miR-30a、TGF-β1、FN、COL1的表达情况。应用TGF-β1刺激HK-2细胞分别检测刺激与未刺激细胞FN、COL1的情况以及circHIPK3、miR-30a的情况。结果:1.FISH和免疫荧光发现,circHIPK3、miR-30a、TGF-β1主要表达在细胞胞质中,进行共染时发现三者在细胞质中共定位。与人的正常肾组织石蜡切片比较,cTIN石蜡切片FISH发现circHIPK3表达升高、miR-30a下降,免疫荧光检测TGF-β1、FN、COL1指标的表达明显升高,半定量分析存在统计学差异。2.经过叶酸腹腔注射后的小鼠同正常组小鼠肾组织进行PAS及MASSON染色发现,与正常对照组相比较,叶酸组肾小管萎缩,部分小管上皮细胞脱落,肾小管间距扩大,炎性细胞浸润明显,间质发生了明显的纤维化。同时行Western blot、q PCR及免疫荧光均证实前纤维化蛋白TGF-β1、FN、COL1明显升高,进一步证实了纤维化模型的成功。与人的结果类似,应用FISH及免疫荧光的方法发现circHIPK3、miR-30a、TGF-β1共定位于细胞质中,且三者无论是两两共定位还是三者共定位都表现出很好的一致性。在纤维化小鼠中,q PCR方法证实circHIPK3表达明显升高,miR-30a表达下降（P<0.001）,TGF-β1表达升高,且circHIPK3和miR-30a,miR-30a和TGF-β1呈现出明显的负相关性。但其他可能与TGF-β1相关的纤维化miR包括miR-29a、miR-29b、miR-146a、miR-338,除miR-338（P=0.02）外,其他指标均无明显统计学差异。3.10%胎牛血清正常培养HK-2细胞,可见细胞贴壁生长,细胞成鹅卵石样外观,无分叶和毛刺。当细胞生长至60-70%时应用质粒进行转染circHIPK3,对照组选用空白质粒,48小时收集细胞进行后续实验。在人HK-2细胞转染circHIPK3后,q PCR证实同对照组相比,circHIPK3升高约5倍,miR-30a下降约一半,前纤维化蛋白TGF-β1、FN、COL1明显升高,Western blot表现出同样的结果。4.当HK-2细胞生长至60-70%时,应用250 pg/ml的h TGF-β1进行刺激,诱导细胞发生纤维化,对照组应用普通培养基继续培养,48小时收集细胞。同对照组相比,显微镜下可见死亡细胞有所增多,部分细胞毛刺及分叶增多,q PCR证实circHIPK3明显升高,miR-30a明显下降,前纤维化蛋白FN、COL1明显升高,Western blot同样确认了纤维化指标的升高。结论:1.circHIPK3在慢性小管间质肾炎患者石蜡切片表达升高,miR-30a表达下降,促纤维化蛋白TGF-β1、FN、COL1明显升高。提示circHIPK3在患者慢性小管间质肾炎中发挥重要作用。2.circHIPK3在大剂量叶酸诱导的肾小管间质纤维化的小鼠模型肾组织中,获得与患者类似的结果,无论是蛋白还是RNA水平,circHIPK3表达升高,miR-30a表达下降,促纤维化因子TGF-β1、FN、COL1表达升高。而且circHIPK3与miR-30a显著负相关,miR-30a与TGF-β1也显著负相关。3.在HK-2中应用三通道染色,发现circHIPK3,miR-30a和TGF-β1共定位于HK-2细胞浆中,说明三个分子间存在相互作用。另外,在HK-2细胞中过表达circHIPK3后,发现miR-30a下调,TGF-β1、FN、COL1表达上调。提示circHIPK3可能通过海绵miR-30a发挥其促纤维化作用。4.TGF-β1处理HK-2细胞后,发现circHIPK3表达增加,miR-30a下调,促纤维化蛋白FN,COL1生成增多。提示在TGF-β1与circHIPK3海绵miR-30a间可能存在一个正反馈环,进一步加重肾小管间质纤维化。