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本论文以玉米小斑病菌为材料,进行了菌丝激发子的分离、纯化、检测,以甜玉米华宝一号作为激发子活性指示材料,并通过SDS-PAGE电泳和MALDITOF MS等技术对激发子进行了分析。
1.经过液氮速冻、机械破碎、离心、PM-10膜高压超滤等步骤,从玉米小斑病菌中提取出玉米小斑病菌粗激发子(CEF)。将CEF经过HiTrap 16/10 DEAE.SepharoseFF阴离子交换层析柱,在A280nm和A220nm下检测,发现4个吸收峰(D1、D2、D3、D4),其中D4峰具有诱导活性,收集峰尖样品即为激发子D4。将D4经过SephacrylS-100凝胶柱层析,在A280nm和A220nm下检测,发现只有一个吸收峰S,经检测S对玉米叶片POD和PAL活性均有诱导作用,表明具有激发子活性,收集S峰尖样品即为激发子S。
2.对粗激发子CEF、初步纯化激发子D4以及最后纯化得到的激发子S进行SDS-PAGE电泳检测,发现其组分逐步得到纯化,激发子S只有一条蛋白条带,达到了电泳纯,测得其分子量为36.8kDa。
3.分别用粗激发子CEF、初步纯化激发子D4以及最后纯化得到的激发子S处理水稻叶片,发现均能使水稻叶片POD及PAL活性增加。随着激发子不断的纯化,其诱导POD及PAL活性升高的幅度也加大。
4.分别对粗激发子CEF、初步纯化激发子D4以及最后纯化得到的激发子S进行性质分析,结果表明其主要成分为糖和蛋白,分子量在10kD以上,初步认为是糖蛋白物质。
5.对最后纯化得到的激发子S进行MALDITOF MS检测,推断其为hypothetical protein SNOG_09682(登陆号是:gi111061827)的同源蛋白,得分值是79,分子量 35787Da.,等电点是6.04。利用蛋白质在线分析软件对hypothetical protein SNOG 09682进行分析,得知其分子量是35694.7Da,分子式是C<,1590>H<,2558>N<,424>O<,493>S<,6>,理论PI为6.04,与质谱分析结果相一致,可能含有20中氨基酸,其中富含.Ala(10.4%)、Leu(9.8%)、Ile(8.3%)、Lys(8.3%)、Ser(8.0%);该蛋白不含信号肽,可能是来自细胞壁的水溶性蛋白;含有1个转二羟丙酮基酶位点(位于32-40位氨基酸),一个转二羟丙酮基酶活性位点(位于131-148位氨基酸);含有比较丰富的二级结构,其中α螺旋(135个氨基酸)占全部氨基酸的41.28%,β折叠区(35个氨基酸),占10.70%,无规则弯曲占48.02%。