Lactobacillus reuteri 121葡萄糖基转移酶GtfBdN作用支链淀粉机制及其改性淀粉产物性质研究

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Lactobacillus reuteri 121 Glucanotransferase GtfB(GtfB)改性淀粉得到的产物是一种可溶性膳食纤维并且具有益生元潜力,因此其在淀粉改性领域具有广阔的应用前景。但目前研究集中于其对直链淀粉的转化机制和产物特性方面,对淀粉的另一种重要组分支链淀粉的作用机制尚未证实,这也导致对淀粉整体改性后的产物性质与酶作用淀粉机制之间的对应关系理解不够深入。因此,本课题探究了其作用支链淀粉的机制并测定了产物的性质,旨在为其改性淀粉以及产物应用于食品提供一定的理论依据。将活性和产物与GtfB相同,但可溶性表达水平大大提高的N-末端截断的GtfB(GtfBdN)在大肠杆菌BL21(DE3)*内表达,并利用镍亲和层析进行纯化。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酶蛋白的纯度和分子量验证,发现经过纯化后的酶能够达到电泳纯,分子量约为100 k Da。利用直链淀粉-碘染色法测得它的酶活为4.12U/mg。对其进行基本酶学性质表征,测得其最适反应条件为温度40℃、p H 5.0。利用GtfBdN对红薯淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、豌豆淀粉、玉米淀粉和蜡质玉米淀粉分别进行改性,测定产物的结构。核磁共振波谱测试发现产物中(α1→6)键含量增加,其中改性后豌豆淀粉的(α1→6)键含量最多为31.3%。高效尺寸排阻色谱测定表明产物的重均分子量(Mw)和旋转半径减小,多分散系数增加,其中改性后马铃薯淀粉Mw为7.2×10~5g/mol,减小最为明显。高效阴离子交换色谱测定发现产物B2链和B3链的相对含量减少,A链的相对含量增加,其中马铃薯淀粉A链的相对含量增加最多,增加了原来的200.0%。以上结果表明,支链淀粉的非还原性末端至距其最近分支点的链段能够被GtfBdN作用。然后利用GtfBdN作用β-极限糊精,发现β-极限糊精能够作为GtfBdN的供体底物被利用产生还原糖,证明支链淀粉的还原性末端至距其最近分支点的链段也能够被GtfBdN作用。最后利用β-淀粉酶和右旋糖酐酶的特异性水解反应,探究支链淀粉能否作为GtfBdN的受体底物,发现支链淀粉不能够作为GtfBdN的受体底物。即支链淀粉是GtfBdN的供体底物而非受体底物,但它的非还原性末端至距其最近分支点的链段以及还原性末端至距其最近分支点之间的链段均可作为供体底物。在研究GtfBdN对淀粉作用机制的基础上,进一步探究GtfBdN改性六种淀粉所得产物的性质,包括所含低聚糖、糊化特性、黏弹特性、热力学性质和体外消化性。高效液相色谱结果表明产物中生成了聚合度1-4的低聚糖,其中以葡萄糖和麦芽糖为主。快速黏度分析仪、流变仪和差示扫描量热法测定发现产物的峰值黏度、崩解值和回生值均降低,各个黏度值均低于30 cp;在测试范围内产物存在过渡黏弹性,但在较长的时间内呈现为流体状态;产物的短期回生和长期回生减慢。体外消化实验测定表明产物的慢消化淀粉和抗性淀粉(RS)含量上升,其中源自豌豆淀粉的产物中RS含量增加最多,增加了原来的124.51%。以上结果表明经GtfBdN改性淀粉后的产物能够抗回生、抗消化,且呈流体状态,可添加入米糊、饮料等食品中具备应用潜质。
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