果蔬原料通过乳酸菌发酵可以改善产品风味,强化营养价值。但橙子、柠檬和青梅等许多水果原料中柠檬酸含量较高,对乳酸菌的生长繁殖和发酵特性产生了显著的抑制。因此筛选出一株耐受性强,发酵性能优良的菌株尤为重要。本论文首先利用前期实验室乳杆菌菌种库中发酵性能较好的分别属于植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的三株乳酸菌,在MRS培养基和不同果蔬汁中进行比较,选择抗逆柠檬酸性能较好的出发菌株进行适应性进化,对驯化后的菌株从细胞形态和细胞膜水平上分析细胞在酸胁迫下的生理应答机制,进一步通过全基因组变异检测解析菌株耐受柠檬酸的机制。最后根据菌株发酵特性,针对不同果蔬原料开发了双菌顺序接种发酵工艺。本研究主要内容如下:（1）利用前期实验室乳杆菌菌种库中发酵性能较好的3株乳杆菌,考察其在添加了不同种类和浓度的有机酸的MRS培养基和十二种典型果蔬汁中的生长性能和发酵特性。发现有机酸种类以及不同菌株之间存在显著的酸胁迫差异,而植物乳杆菌D（LP-D）、植物乳杆菌F（LP-F）和鼠李糖乳杆菌S（LR-S）分别针对苹果酸、柠檬酸和酒石酸具有更加显著的耐受性。因此,选择LP-D作为出发菌株进行适应性进化。（2）利用实验室连续传代适应性进化策略和全自动高通量微生物液滴培养仪（MMC）两种策略对出发菌株LP-D进行驯化,得到了系列子代抗逆性能提高的菌株。其中实验室连续传代适应性进化策略由于其菌浓检测范围较宽的优势,得到的驯化后菌株对柠檬酸的抗逆效果更好。在驯化378代后,实验室适应性进化后的菌株在1.5%柠檬酸浓度下比MMC进化后的生长OD提高了1.9-3.1倍,乳酸积累量比它提高了1.6-2.6倍。因此后续传代驯化均选用实验室适应性进化。（3）LP-D在逐渐提高浓度的柠檬酸条件下,连续传代进化180天,共计1260代,柠檬酸浓度从0.5%提高到2%,菌株的抗逆性能逐渐提高,生长逐渐稳定。出发菌株LP-D在1%柠檬酸浓度下,OD为1.85,在2%浓度下完全不生长,但驯化后获得的LPD-1260在1%柠檬酸浓度下OD为5.67,2%柠檬酸浓度下生长OD能达到2.68,乳酸积累量达到15.9 g·L-1,体现出显著提高的柠檬酸耐受性。LPD-1260菌株通过连续无环境压力的培养以及长时间保藏后再进行性能测试,发现其获得的抗逆性具有遗传稳定性。（4）对驯化不同阶段的菌株进行显微镜镜检和扫描电镜镜检,发现驯化后的菌株LPD-840和LPD-1260的培养液中部分细胞的杆状长度变长,LPD-840大约变长为LP-D的4-5倍,LPD-1260大约变长为LP-D的7-8倍。在培养过程中每隔4 h对驯化后LPD-1260镜检观察,在8 h、12 h、16 h和20 h的镜检图中均有个别子代杆状长度变长,而出发菌株没有这一现象,因此初步排除了细胞形态的变化与生长期有关。通过流式细胞仪对菌体长度的分选和分析,发现随着驯化代数的增加,以及柠檬酸浓度的增加,形态变长的比例有所增加,并且细胞的杆状长度增加幅度变大。LPD-1260平均单个细胞的长度变长为LP-D的3.3倍,其中长杆状细胞的长度变长为LP-D的6.04倍,细胞变长的占比占到了所有细胞的17.2%;通过流式细胞仪进一步将不同代数的短杆状和长杆状的细胞分选收集后,分别培养,发现长杆状的细胞亚群具有更强的柠檬酸抗逆性能;并且发现高柠檬酸会诱导子代细胞长度增加。（5）细菌的细胞膜是抵御外界环境胁迫的第一道防御屏障,乳酸菌可以根据外界生长条件的变化而改变其细胞膜中的脂肪酸组成,来减少环境胁迫对细胞造成的损伤。因此,我们分析了适应性进化前后菌株在不同柠檬酸浓度下细胞膜中脂肪酸的种类与含量,发现C16:0和C18:0占据了脂肪酸的大部分比例,达到90%-98%,驯化后菌株的C18:0都低于出发菌株。起初菌株在柠檬酸胁迫下细胞膜组成种类较多,随着驯化代数增加,细胞膜脂肪酸组成减少,并且脂肪酸不饱和度和碳链长度也随之增加。且在不同柠檬酸浓度下同一进化代数的细胞膜脂肪酸的种类和含量存在显著差异。（6）基于全基因组重测序的变异检测,发现LPD-840有106个SNP和61个Indel,LPD-1260有105个SNP和55个Indel。COG注释后,与碳水化合物的运输和代谢、氨基酸的转运和代谢、细胞壁/膜/包膜生物发生和转录相关的基因个数最多;KEGG注释后,代谢途径、氨基酸生物合成和次级代谢产物生物合成相关的基因个数最多。其中发现了一个基因通过NR和SWISSPROT注释出的蛋白信息是核苷酸封闭蛋白,注释后与细胞周期控制、细胞分裂和染色体分区的功能有关,据报道该蛋白可以在细菌面临环境胁迫时,通过降低分裂保护染色体。因此,分析认为驯化后菌株细胞形态发生的变化很有可能与这个基因的突变有关。（7）将获得的抗逆菌株在不同果蔬汁中进行发酵,针对柠檬酸为主体有机酸的高柠檬酸果蔬汁,例如青梅汁、柠檬汁和西番莲汁,LPD-1260单菌发酵具有显著的优势;针对有机酸较复杂的果蔬,由于驯化后LPD-1260针对其他有机酸耐受性降低的特点,建立了双菌顺序接种发酵工艺,通过不同菌株对不同有机酸的耐受特性和代谢特性,实现协同高效发酵,较单菌株工艺其具有显著优势。