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研究目的:转录因子PBX1(pre-B-cell leukemia homeobox 1)是TALE同源盒基因家族成员之一,在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞的增殖、迁移中起到重要的抑制作用。我们课题组的前期研究发现在前列腺癌中PBX1可以通过泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP)发生降解,并且发现了去泛素化酶USP9X能够与PBX1结合并剪切PBX1的多聚泛素链而稳定PBX1。但是介导PBX1多聚泛素化而靶向蛋白酶体降解的泛素连接酶目前尚无报道。本研究旨在发现参与PBX1泛素化降解的相关蛋白酶,并阐明其作用机理,为非小细胞肺癌细胞的靶向治疗提供参考。研究方法:1.用蛋白酶体抑制剂MG132处理肺癌细胞株A549,用Western Blot方法检测PBX1的蛋白水平,并用PBX1抗体做免疫沉淀实验检测PBX1的泛素化水平。2.用LC-MS方法鉴定PBX1相结合蛋白,在HEK293T细胞中转染Flag-PBX1,免疫沉淀PBX1后用高效液相-质谱联用的方法鉴定与PBX1相结合蛋白质。3.质谱数据表明TRIM26可能与PBX1相互结合,通过免疫沉淀、免疫荧光方法,验证TRIM26与PBX1是否存在相互结合;并构建TRIM26的不同截断体质粒与PBX1质粒共转染到HEK293T细胞中用免疫沉淀实验确定TRIM26与PBX1相互结合的重要结构域。4.在过表达或敲低TRIM26后,采用Western Blot方法从内源性及外源性两方面探讨TRIM26对PBX1蛋白稳定性的影响。在A549细胞中过表达TRIM26后通过RT-PCR实验检测PBX1的mRNA水平以确定TRIM26对PBX1蛋白水平和mRNA水平的影响。5.在A549细胞中转染TRI]M26,分别用蛋白酶体抑制剂或溶酶体抑制剂处理细胞后,用Western Blot分析TRIM26介导PBX1蛋白降解途径。6.在过表达TRIM26条件下,给予细胞放线菌酮处理,后用WB技术分析TRIM26对PBX1蛋白的稳定性及半衰期的变化。7.在HEK293T细胞中过表达TRIM26、PBX1、Ub的条件下通过免疫沉淀实验检测TRIM26对PBX1泛素化及泛素化类型的影响;在A549和H226细胞中过表达TRIM26或者敲低TRIM26后通过免疫沉淀实验检测内源性PBX1泛素化的影响。8.构建PBX1特异性识别元件的荧光素酶报告基因质粒,通过测定报告基因荧光素酶活性的方法分析TRIM26对PBX1转录活性的影响。9.收集肺癌病人样本用RT-PCR方法检测TRIM26的mRNA水平,并用Western Blot方法检测TRIM26和PBX1的蛋白水平以探究TRIM26与PBXI临床相关性。10.用MTT实验及克隆形成实验分析TRIM26对非小细胞肺癌细胞的增殖及克隆形成能力的变化。实验结果:1.采用WB技术分析发现肺癌细胞株A549经蛋白酶体抑制剂(MG132、硼替佐米)处理后,均可以使肺癌中内源性PBXI蛋白水平上调,而细胞给予溶酶体抑制剂CHQ及巴弗洛霉素A1处理,PBX1蛋白水平未见变化;通过IP实验发现细胞经MG132处理后,PBX1的泛素化水平明显上升,提示在肺癌中PBX1可以通过泛素蛋白酶体途径降解。2.通过LC-MS分析与PBX1相结合的蛋白质,发现包括泛素连接酶TRIM26、HUWE1.UBR4。3.在HEK293T细胞中用Co-IP实验发现TRIM26与PBX1相互结合,A549细胞中内源性的Co-IP分析进一步确证了 TRIM26与PBX1相互结合。免疫荧光实验显示TRIM26和PBX1主要共定位在细胞核内。在HEK293T细胞的过表达体系中确定了 TRIM26的SPRY结构域是TRIM26与PBX1相互结合的关键结构域。4.在HEK293T细胞过表达PBX1和TRIM26后,TRIM26可以呈时间梯度和浓度梯度依赖性下调PBX1的蛋白水平;进一步发现在A549和H226细胞中过表达TRIM26可以下调PBX1蛋白而敲低TRIM26后可以上调PBX1蛋白;同时TRIM26不影响PBX1的mRNA水平而下调PBX1的下游靶基因RNF6的mRNA水平。5.TRIM26降低PBX1的蛋白水平,其效应可被蛋白酶体抑制剂逆转而不能被溶酶体抑制剂逆转。6.CHX chase实验结果表明TRIM26可以下调PBX1的蛋白水平和缩短PBX1的半衰期。7.通过免疫沉淀实验证明了 TRIM26可以增强PBX1的泛素化水平,并用Ub突变体与TRIM26、PBX1共转染实验,发现TRIM26促进PBX1的泛素化类型主要是K48-类型的多聚泛素化。8.荧光素酶报告基因实验证明TRIM26可以抑制PBX1的转录活性。9.肺癌病人的组织样本的mRNA和蛋白水平检测发现TRIM26在肺癌组织中表达量明显高于癌旁组织;PBX1蛋白在癌组织的表达量明显低于癌旁组织,提示TRIM26的表达与PBX1的表达呈负相关,TRIM26在肺癌中作为癌基因存在。10.在A549中转染TRIM26后,PBX1的蛋白水平下调,MTT和克隆形成实验结果显示随着时间的延长,过表达TRIM26促进A549细胞的增殖和克隆形成;在H226细胞中转染TRIM26小干扰RNA,PBX1的蛋白水平上调,MTT和克隆形成实验结果显示随着时间的延长,敲低TRIM26抑制H226细胞增殖及克隆形成。结论:通过LC-MS/MS的方法找到了 PBX1相互结合蛋白TRIM26,TRIM26的SPRY结构域是TRIM26与PBX1相互结合的关键结构域,结合后增强PBX1的K48-多聚泛素化而降解PBX1而抑制其转录活性。TRIM26可以介导PBX1降解促进非小细胞肺癌细胞的增殖,可能为非小细胞肺癌的靶向治疗提供理论基础。