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空气污染是世界性的环境问题,在我国,空气污染面积大,持续时间长,暴露人群多,问题尤为突出。颗粒物作为空气污染物的主要成分,可引起多种健康危害,包括呼吸系统疾病、心血管系统疾病甚至癌症。美国癌症协会对50万名研究者进行长达16年的研究,发现当空气中细颗粒物(Particulate matter with aerodynamic diameter less than 2.5μm,PM2.5)的浓度长期高于 10μg/m3,可以引起死亡风险的增加,PM2.5的浓度每升高10μg/m3,总死亡风险增加4%,心肺疾病引起的死亡风险增加6%,肺癌引起的死亡风险增加8%。在颗粒物诱导不良健康效应的过程中,microRNAs(miRNAs)发挥着重要的调控作用,其通过碱基配对的方式靶向结合mRNA 3’端非编码区,从而促进目标mRNA降解或抑制其翻译,最终影响基因的表达水平。此外,miRNAs与炎症的关系非常密切,可以通过上调或下调炎性细胞因子的水平发挥促炎或抗炎的作用,但在颗粒物暴露引起机体炎性反应过程中,miRNAs发挥的作用尚不明确。氧化应激与炎症是紧密联系且相互依赖的病理生理过程,大量研究表明,在颗粒物暴露诱导的炎性反应中,氧化应激参与其中甚至起决定作用。除了与炎症的关联,氧化应激作为颗粒物诱导不良健康效应的常见机制之一,还可能进一步诱导其他生物学事件的发生,如细胞器功能紊乱。线粒体、溶酶体和内质网是三种重要的细胞器,分别与细胞的凋亡、内吞及稳态相关。在颗粒物的暴露过程中,线粒体、溶酶体和内质网可成为颗粒物的作用靶点,其功能异常的出现早于明显的疾病结局,因此可以作为损害的早期标志,此外,这些亚细胞结构功能的异常改变有助于我们认识损害的病理生理机制。目前,颗粒物暴露引起线粒体、溶酶体和内质网毒性效应的研究仍较少,相关问题仍需探讨。为了解决上述科学问题,本研究选取了三种代表性的颗粒物,从四个方面展开研究:一是以柴油机尾气颗粒物(Diesel exhaust particle,DEP)作为颗粒物代表,通过单次及重复气管滴注诱导小鼠肺部炎性反应,揭示肺组织中IL-6、let-7 microRNA、LIN28B等观察指标的变化规律。二是在体外通过沉默LIN28B基因及过表达let-7,进一步验证LIN28B/let-7轴在颗粒物诱导炎性反应中的作用。三是运用高内涵(High-content screening,HCS)技术研究炭黑(Carbon black,CB)、DEP及PM2.5三种颗粒物在肺相关的三种细胞中对氧化应激和细胞器功能的影响,并比较三种颗粒物的毒性差异和三种细胞的敏感性差异。四是以CB为颗粒物代表,在体外进一步验证氧化应激在颗粒物诱导线粒体及溶酶体功能紊乱以及凋亡中的作用。一、DEP暴露诱导肺部炎性反应中let-7及相关指标体内研究在单次气管滴注部分,将90只C57BL/6J小鼠随机分成10组,每组9只,设5个观察时间点,分别为0.5h、6h、12h、24h和48h,每个时间点分别设一个实验组和一个对照组。所有实验组小鼠均单次滴注50μl DEP悬液(含100μg DEP),对照组小鼠均单次滴注50μl DEP溶剂,根据各自时间点处死小鼠。在重复气管滴注部分,将30只C57BL/6J小鼠随机分成3组,每组10只,分别为对照组(每只每次滴注50μl DEP溶剂),低剂量组(每只每次滴注50μl DEP悬液,含12.5μg DEP)组及高剂量组(每只每次滴注50μl DEP悬液,含50μg DEP)。每周一、三、五共滴注3次,连续4周共滴注12次,末次滴注结束24h后,处死小鼠。单次及重复气管滴注部分,每组均随机选取3只小鼠,按照标准方法制作肺组织病理切片。采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,H&E)对肺组织切片进行染色,采用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测肺组织IL-6蛋白水平,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定肺组织中let-7家族成员的表达水平,采用免疫印迹实验(Westen blot)检测肺组织LIN28B蛋白水平。结果显示,单次气管滴注后,在6h、12h及24h时间点,与对照组相比,DEP组小鼠肺组织病理图像显示大量的中性粒细胞浸润,支气管黏膜上皮细胞部分脱落及肺泡壁增厚等病理改变,病理评分也显著升高(P<0.05);而且DEP组小鼠肺组织IL-6蛋白水平显著升高(P<0.05),let-7d和let-7g水平显著下降(P<0.05),LIN28B蛋白水平显著上升(P<0.05)。重复气管滴注后,与对照组相比,低剂量组和高剂量组小鼠肺组织均出现了明显的异常改变,包括中性粒细胞浸润、毛细血管出血及肺泡壁增厚,小鼠肺组织的病理评分也显著升高(P<0.05);而且低剂量组和高剂量组小鼠肺组织IL-6蛋白水平显著升高(P<0.05),let-7d和let-7g水平显著下降(P<0.05),LIN28B蛋白水平显著升高(P<0.05)。二、LIN28B/let-7轴在DEP暴露诱导肺部炎性反应中的调控作用研究本实验采用两个支气管上皮细胞系16HBE及Beas-2B,同样设七个处理组:对照组、DEP 组、Si-LIN28B 组、SiRNA NC 组、Let-7d 组、Let-7g 组和Mimic NC组。对照组无处理因素;DEP组暴露于100μμg/ml DEP 24h;Si-LIN28B 组和 SiRNA NC 组分别转染小干扰 RNA(Small interfering RNA,siRNA)si-LIN28B和siRNA NC以沉默LIN28B基因,然后按照上述DEP剂量暴露 24h;Let-7d 组、Let-7g 组和 Mimic NC 组分别转染 let-7d mimic、let-7g mimic及mimic NC以过表达let-7d或let-7g,同样按照上述DEP剂量暴露24h。转染及DEP暴露过程结束后,将各组细胞用Trizol裂解,提取总RNA并反转录成cDNA。采用Real-time PCR测定let-7d、let-7g和IL6 mRNA的水平。结果显示,不同组间let-7d、let-7g及IL6 mRNA三个指标各自的变化趋势在16HBE和Beas-2B两个细胞系中高度一致。DEP组let-7d及let-7g表达水平均显著低于对照组(P<0.05),而IL6 mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)。Si-LIN28B组let-7d和let-7g的表达水平均显著高于SiRNA NC组(P<0.05),而IL6 mRNA 水平显著低于 SiRNA NC 组(P<0.05)。let-7d 组和 let-7g 组 IL6 mRNA的表达水平与Mimic NC组相比均显著下降(P<0.05)。三、三种典型颗粒物暴露诱导细胞氧化应激及细胞器功能紊乱的研究将人支气管上皮细胞(16HBE)、人胚肺成纤维细胞(HELF)及人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)三个细胞系分别暴露于不同浓度的CB、DEP及PM2.5染毒液24h,用CCK-8试剂盒检测细胞的存活率,用特异性荧光探针结合高内涵技术检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、线粒体超氧化物、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)、细胞内ATP、溶酶体pH值、细胞内Ca2+水平,用Real-time PCR定量分析HO-1、NQO1、CHOP和XBP-1s mRNA的水平。结果显示,暴露于三种颗粒物后,仅HUVEC细胞存活率存在明显下降趋势,而暴露于CB后,三种细胞的存活率均呈明显下降趋势。暴露于三种颗粒物后,三个细胞系ROS水平均不同程度升高,提示出现了明显的氧化应激。与对照组相比,CB暴露后三个细胞系线粒体超氧化物的水平均不同程度升高(P<0.05),PM2.5暴露后仅HELF细胞系在100Hg/ml暴露浓度时线粒体超氧化物的水平显著升高(P<0.05)。三种颗粒物暴露后三个细胞系MMP及细胞内ATP的水平与对照组相比均不同程度降低(P<0.05)。与对照组相比,CB暴露后三个细胞系溶酶体pH值均显著升高(P<0.05),DEP及PM2.5暴露后仅HUVEC细胞中溶酶体pH值显著升高(P<0.05)。与对照组相比,CB暴露后,16HBE细胞内Ca2+水平显著升高(P<0.05),16HBE及HUVEC细胞系CHOP及XBP-1s的mRNA水平均升高(P<0.05)。四、氧化应激在CB颗粒诱导的细胞器功能紊乱及凋亡中的作用研究本部分实验以CB为颗粒物代表,暴露人支气管上皮细胞Beas-2B。设对照组、三个CB剂量组(25、50及100μg/ml)及N-乙酰半胱氨酸(N-Acecyl-L-cysteine,NAC,2mM)+50μg/ml组,根据分组将细胞分别暴露24h。用CCK-8试剂盒检测细胞的存活率,用特异性荧光探针结合高内涵技术检测细胞内ROS、MMP及溶酶体pH值水平,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果显示,50、100及200μg/ml CB暴露组与对照组相比,其细胞存活率显著下降(P<0.05)。25、50及100μg/ml CB暴露组与对照组相比,其ROS水平均显著升高(P<0.05),而NAC+50μg/ml组与单纯50μg/ml CB暴露组相比,其ROS水平显著降低(P<0.05)。50及100μg/ml CB暴露组与对照组相比,MMP水平均下降(P<0.05),溶酶体pH值均上升(P<0.05),细胞凋亡率均显著上升(P<0.05)。而NAC+50μg/ml组与单纯50μg/ml CB暴露组相比,MMP水平均上升(P<0.05),溶酶体pH值均下降(P<0.05),细胞凋亡率均显著下降(P<0.05)。结论1、DEP气管滴注在小鼠肺部引起明显的病理损伤并伴有大量中性粒细胞浸润,肺组织IL-6分泌增加,LIN28B蛋白水平升高,而let-7d和let-7g表达水平下降,提示DEP诱导的炎性反应可能通过LIN28B/let-7轴介导。2、采用RNAi技术沉默LIN28B基因,可减轻DEP暴露所致的let-7d和let-7g表达水平的下调以及IL6 mRNA水平的上调,提示LIN28B是let-7d、let-7g及IL6的上游调控基因;过表达let-7d和let-7g可减轻DEP暴露所致IL6 mRNA水平的上调,提示let-7d和let-7g是IL6基因的上游调控因子。3、CB、DEP及PM2.5三种颗粒在三个细胞系中均引起了氧化应激及线粒体功能紊乱,在HUVEC中均引起了溶酶体碱化,但只有CB在16HBE及HUVEC细胞系中诱导出内质网应激反应。相比于DEP及PM2.5,CB表现出更强的毒性效应,这将有助于认识纳米尺寸颗粒物毒性特征的复杂性。而颗粒物诱导的毒性效应呈现细胞类型依赖性的特点,提示肺部不同组织对颗粒物暴露的敏感性差异。4、CB暴露人支气管上皮细胞Beas-2B引起了明显的氧化应激反应,而氧化应激反应又导致MMP下降和溶酶体pH值上升,这可能进一步诱导了细胞凋亡的发生。该结果有助于认识CB引起呼吸系统损伤效应的病理生理机制。