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绝经后妇女由于雌激素水平下降,易于引发骨质疏松,对骨质疏松与颌骨、牙槽骨关系的研究表明,骨质疏松症的绝经后妇女下颌骨量与全身骨量有明显的相关关系,绝经后可出现不同程度的牙槽骨骨质疏松症状[1-4]。雌激素替代疗法(estrogen replacement treatment,ERT)可有效提高绝经期妇女体内雌激素的水平,是预防绝经后骨质疏松症及骨折的有效方法[2],同时,ERT也可减少牙周炎患者的牙龈出血和附着丧失,维持牙槽骨的骨量,提高牙齿的保留率[5,6]。牙周膜细胞是牙周膜内的主要成分,对维持牙周膜的形态、功能有决定性的作用,并且在牙槽骨的改建中发挥重要作用。以往的研究显示牙周膜细胞内有雌激素受体的表达,而且在外源性雌激素作用下,牙周膜细胞的成骨作用增强[7]。在牙周膜内有数种细胞成分,除占主要地位的牙周膜成纤维细胞外,还有成骨细胞、破骨细胞及未分化间充质细胞--牙周膜干细胞(PDLSCs),PDLSCs是牙周膜内各主要功能细胞的来源[8],而PDLSCs与雌激素在牙周改建及再生过程中的关系尚无研究报道。由此,我们设想,牙周膜干细胞内是否也有雌激素受体的表达,如果有雌激素受体表达,外源性雌激素对牙周膜干细胞成骨作用有何影响?通过本研究,我们将对这些问题进行探讨,以进一步明确雌激素在牙周改建及再生中的作用机制,为牙周病及正畸临床治疗提供一定新的思路和理论基础。实验内容:(1)收集临床拔除的正常人牙周健康、无龋的新鲜第三磨牙,刮取根中1/3牙周膜组织进行牙周膜原代细胞培养。取第四代人牙周膜细胞,通过免疫磁珠技术,以复合间充质干细胞的表面标记物STRO-1抗体的磁珠对人牙周膜干细胞进行筛选、扩增培养,MTT法测定PDLSCs生长曲线并与牙周膜细胞进行比较。(2)取第三代PDLSCs进行克隆形成率、细胞周期分析,对其生物学行为进行研究;以流式细胞仪对PDLSCs及牙周膜细胞进行细胞表面特异性抗原CD34、CD44、CD45、CD146表达测定;以免疫细胞化学方法对PDLSCs进行干细胞表面特异性抗原STRO-1及间充质细胞相对特异性抗原Vimentin表达测定;PDLSCs成脂及成骨多向诱导分化研究。通过上述实验对所分离的PDLSCs干细胞特征进行鉴定。(3)取第三代PDLSCs以免疫细胞化学方法进行ERα及ERβ特异性抗体染色;以逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测PDLSCs在雌激素作用前后ERα及ERβmRNA表达的变化并与牙周膜细胞作比较研究;以Western blot法分析PDLSCs在雌激素作用前后ERα及ERβ蛋白表达的变化并与牙周膜细胞作比较研究。(4)取第三代PDLSCs进行成骨诱导,加入不同浓度梯度(10-7、10-8、10-9M)的外源性雌激素(17β-雌二醇),MTT法测定成骨分化过程中的PDLSCs在雌激素作用下的细胞增殖变化情况。(5)取第三代PDLSCs进行成骨诱导,加入不同浓度梯度(10-7、10-8、10-9M)的外源性雌激素(17β-雌二醇),并以ER抑制剂ICI182780作对照,进行碱性磷酸酶(ALP)表达变化及羟脯氨酸含量的检测。结果:(1)所筛选PDLSCs呈类梭形外观,形态不规则,核为卵圆形、位于胞质中央,似成纤维样细胞。细胞生长曲线示可见PDLSCs较牙周膜细胞生长慢,具有慢增殖周期的干细胞特点。(2)PDLSCs生物学研究显示其具备克隆形成能力及干细胞细胞周期特点,流式分析显示所分离PDLSCs高表达间充质干细胞表面标记物CD44及CD146,内皮细胞及造血系细胞表面标记物CD34和CD45表达极低;干细胞表面特异性抗原STRO-1及间充质细胞相对特异性抗原Vimentin染色均为阳性,此外,PDLSCs经成脂及成骨诱导获得了茜素红染色阳性的类成骨细胞和油红-O染色阳性的类脂肪细胞。(3)免疫细胞化学染色显示ERα及ERβ在PDLSCs中均阳性表达,定位于细胞核;RT-PCR及Western blot检测示:在mRNA及蛋白水平,均可检测到ERα及ERβ表达,且ERα表达高于ERβ。此外,PDLSCs与同来源牙周膜细胞相比, ERα及ERβ的表达较高;而PDLSCs在雌激素作用后ERα及ERβ的表达较作用前均增加。(4)在17-β雌二醇作用下,PDLSCs的增殖发生变化,与对照组相比,前3天雌激素干扰组细胞增殖受到抑制,此后雌激素干扰组细胞增殖高于对照组,在不同药物浓度组间,1×10-7M组对细胞增殖影响最为明显,其细胞增殖水平高于其余两组。(5)在17-β雌二醇作用下,PDLSCs碱性磷酸酶(ALP)的表达发生动态变化,自第三天开始,各组ALP表达均升高,而雌激素干扰组ALP表达量高于对照组,在不同药物浓度组间1×10-7M组ALP表达增加高于其余两组。(6)在17-β雌二醇作用下,PDLSCsⅠ型胶原合成表达与对照组相比有增加趋势,且与药物浓度有剂量依赖关系,在不同药物浓度组间1×10-7M组作用最为明显。结论:(1)用复合间充质干细胞特异性抗体STRO-1的免疫磁珠可自牙周膜细胞中成功筛选PDLSCs,所筛选PDLSCs具有克隆形成、慢细胞周期、表达干细胞特异性标记物及多向分化能力等干细胞特点。(2)PDLSCs中ERα及ERβ均有表达,ERα表达高于ERβ,提示雌激素对PDLSCs的调控作用可能主要通过ERα途径;在外源性雌激素作用下,成骨分化过程中ERα及ERβ表达均增加,提示PDLSCs可能是雌激素调控牙周改建的上游细胞,雌激素通过其受体对PDLSCs的成骨分化进行调控。(3)雌激素可促进PDLSCs的增殖,并对PDLSCs成骨分化过程有促进作用,该作用与ER及雌激素浓度密切相关,提示雌激素可以通过PDLSCs促进牙周改建及再生,对牙周损伤的恢复有积极的作用。