海藻糖,新型非还原性二糖,具有优良的保护特性。可在高热环境下保护食品、化妆品和药物,稳定其中含有的蛋白的结构不变性,因此,使得海藻糖的商品化前景潜力巨大。海藻糖的生产工艺复杂,导致生产成本过高,阻碍了海藻糖的应用。本研究以融合了β-淀粉酶基因和海藻糖合酶基因的双功能融合酶蛋白为基础,通过分离纯化手段去除杂蛋白,分析融合酶的酶学特性,通过优化刚性连接肽长度获得比较稳定、高效的双功能融合酶。本研究首先在M9培养基的基础上,采用单因素结合正交法优化培养基,并命名为M9-MZ,并对诱导表达条件进行了优化。优化后融合酶BT3在pH 7.0、45℃下以6%的直链淀粉为底物催化反应6 h后,海藻糖的浓度最高为18.52 g/L,海藻糖转化率为30.87%,粗酶液的酶活力为13.6 U/mL。与M9-ZJ-LM培养基得到的结果相比,融合酶酶活力提高了28.5%。本研究根据融合酶的6×His-tag标签,首先采用Ni-NTA亲和层析进一步结合阴离子交换层析得到纯融合酶,最终的纯化倍数为12.97,酶活力回收率为25.37%。经过测定酶学性质:最适反应温度为40℃;最适pH8.0,向碱性方向偏移了0.5个单位;热稳定性比单酶高,耐碱能力也高于单酶;3 mmol/L金属离子Ba²⁺、Co²⁺、Cu²⁺存在下三种酶的活力明显受到抑制,Mg²⁺对酶活力有促进作用。经过HPLC测定,融合酶BT3的酶活力为92.4 U。催化6%直链淀粉溶液,纯化后的融合酶BT3转化海藻糖浓度为33.72g/L,产率为56.2%,比纯化前（18.52g/L,30.9%）提高了26.7%,融合酶BT3的海藻糖产率与混合酶系相比提高了6%。本研究通过替换不同长度的刚性连接肽（EAAAK）n,n=2-4,重新得到了三种融合酶BT3-A,BT3-B,BT3-C。通过比较纯化后三种融合酶催化6%直链淀粉溶液,海藻糖浓度分别为:30.36 g/L、32.29 g/L和37.99 g/L。其中,BT3-C催化得到的海藻糖浓度高,海藻糖产率达到63.32%。与连接肽替换前的融合酶BT3（33.72g/L,56.2%）相比海藻糖产率高7.12%,这初步说明连接肽长度对两端的单酶产生了不同的影响,选择合适的长度,可以适当提高融合酶的酶活力。