海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10Δ~4脱饱和酶基因的克隆及表达

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二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一种具有重要生理功能的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs),其资源及合成机制已成为研究热点。 为阐明海洋真菌中DHA的生物合成机制及构建高产DHA的工程菌株或植株,本研究对Thraustochytrium sp FJN-10中DHA生物合成的关键酶—脱饱和酶基因进行了克隆与表达,主要研究内容与取得的成果体现如下:(1)采用松花粉垂钓法分离获得菌株FJN-10,该菌株生活史中有营养细胞、孢子囊和孢囊孢子;脂肪酸分析显示其油脂中的不饱和脂肪酸含量高,组成简单,DHA含量为43.1%,占PUFAs的71.1%;对其18S rRNA基因进行克隆测序(GenBank登录号:AY773276),并建立系统进化树,分析表明该菌与海洋真菌Thraustochytrium sp MBIC11092具有紧密的亲源关系。(2)就温度及时间对FJN-10发酵产DHA的影响进行探讨,并以此为基础,制备高丰度脂肪酸脱饱和酶基因的总RNA样品;通过RT-PCR及cDNA末端扩增(Rapidamplification of cDNA ends,RACE),获取△4-脂肪酸脱饱和酶cDNA的全长基因,序列分析显示其开放阅读框由1560个核苷酸组成,共编码519个氨基酸;对其基因组结构分析表明,△4-脂肪酸脱饱和酶基因不存在内含子序列。(3)为验证所克隆cDNA序列的基因功能,构建了重组表达载体,并以尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVScl作为宿主进行功能表达分析,在添加外源性底物脂肪酸肾上腺酸(Adrenic acid,ADA,C22:4△7,10,13,16n-6),经半乳糖诱导之后,转基因酵母合成了二十二碳五烯酸(Docosapentaenoic acid,ω6-DPA,22:5△4,7,10,13,16n-6),从而确定了△4-脂肪酸脱饱和酶的活性。 本研究是Thraustochytrium sp.FJN-10 △4-脂肪酸脱饱和酶基因研究的首次报道。
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