越来越多的研究开始关注饮食健康和安全,这些研究成果同时也促进了功能食品和保健品新概念的提出与发展。现如今,食品不仅仅是营养和能量摄入的来源,并且可以作为身体所需功能保健因子的补充剂。生物活性多肽是饮食功能营养补充剂之一,它被人体消化以后可以产生多种基础营养功效。蛋白源食物中的抗氧化多肽,不仅可以在食品抗氧化剂生产工业中进行应用,并且可以作为功能保健品研发的材料,用以控制人体的氧化应激水平,保持机体健康。食用菌开发利用的历史可以追溯到千年以前,它不仅是美味的食材,还是中药材的制备原料。研究人员已经从食用菌中鉴定出了多种具有生物活性的成分,比如多糖、蛋白、多肽、脂质和次级代谢产物等。白蘑菇（双孢菇）的栽培和消费遍布全世界。虽然对于双孢菇功能活性物质已有部分研究报道,但是双孢菇蛋白中的活性多肽的研究依然缺乏数据和理论支撑。因此,本研究的目的是利用酶法制备、纯化和鉴定双孢菇蛋白提取物中具有抗氧化性的多肽。本研究利用硫酸铵沉淀法提取双孢菇子实体中的蛋白,采取三种食用级蛋白酶对提取的蛋白进行单一和复合酶解处理。该方法的酶解多肽得率在57%到95%之间,蛋白水解的回收率在44%到82%之间,表明该方法酶解过程的效率和敏感度符合实验要求。此外,实验还利用凝胶电泳验证了蛋白的酶解产物,结果表明高分子量多肽已经降解为低分子量多肽,这个过程可以促进多肽的抗氧化性。风味蛋白酶的蛋白水解度显著（p<0.05）低于其他酶解方式,这一结果表明蛋白水解物与酶的种类相关。从蛋白电泳胶条结果可以得出,胰蛋白酶和碱性蛋白酶可以完全水解消化高分子多肽。对水解产物的氨基酸组成分析可以看出,水解产物主要由带负电的氨基酸组成,这些氨基酸往往会赋予多肽抗氧化的特性。除了碱性蛋白酶,其他酶的酶解产物均具有高氨基酸含量,并显著提高多肽的脂溶性,该特点可以促进多肽和自由基的相互作用。实验获得的酶解产物进一步经过超滤得到四个超滤组分,其分子量范围分别为<1 kDa、1-3 kDa、3-5 kDa和5-10 kDa MW。低分子量超滤组分的高得率和回收率证明了该酶解超滤方法的效率和敏感度。本实验利用DPPH自由基清除实验、金属螯合作用、还原能力和亚油酸氧化抑制作用四个实验测定蛋白酶解产物和超滤组分的抗氧化特性。和超滤组分相比,蛋白酶解产物表现出更高的金属螯合能力,这可能是由于水解产物中各个多肽之间的协同作用导致。水解产物中相比于其他组分,分子量1-3 kDa之间的超滤组分表现出最强的金属螯合作用,这暗示着这个分子量的超滤组分含有大量的带负电氨基酸。蛋白水解产物的DPPH清除能力取决于酶解过程,胰蛋白酶水解产物表现出最高的DPPH自由基清除活性（EC50值为0.25 mg/mL）。分子量1-3 kDa之间的超滤组分表现出最强的DPPH自由基清除作用。蛋白水解产物和超滤组分的还原能力与它的浓度呈现正相关的关系。胰蛋白酶水解产物表现出最高的还原能力,同时,碱性蛋白酶对水解产物的还原能力无显著性影响（p>0.05）。对于各个超滤组分,分子量1-3 kDa之间的超滤组分表现出最强的还原能力。在1 mg/mL浓度下,谷胱甘肽比蛋白水解产物或超滤组分具有更高的还原能力。此外,实验发现蛋白酶解产物可以维持亚油酸在四天内不被氧化。在第五天时,各个酶解产物均可以保持50%以上的亚油酸氧化抑制能力。分子量1-3 kDa之间的超滤组分对DNA质粒pUC19表现出显著（p<0.05）的由羟自由基诱导的氧化损伤的保护作用。和阴性对照相比,10 mg/mL分子量1-3 kDa的超滤组分对DNA损伤保护率达到68.9%。胰蛋白酶超滤后分子量1-3 kDa之间的超滤组分表现出强烈的抗氧化作用,因此它被选为进一步深入研究的对象。通过凝胶色谱法分离出六个组份,其中中等分子量肽段（F2）表现出显著的DPPH自由基清除活性。随后利用离子交换色谱对F2肽段进行进一步分离得到四个组分,其中组分C（带弱正电）和组分D（带负电）表现出强劲的DPPH自由基清除作用。因此,本研究利用反相高效液相色谱对组分C和D进行进一步的分离纯化,纯化后的组分比原先蛋白酶解产物的DPPH自由基清除能力高出了两倍。随后,以HepG2和Caco-2建立细胞模型,研究组分C和D对由H2O2诱导的细胞氧化损伤的保护能力,其中测定指标包括了细胞活力、细胞内还原状态、细胞自由基积累、脂质过氧化水平和乳酸脱氢酶（LDH）活性。实验结果表明,组分C和D可以通过降低LDH活性保护细胞完整性,减缓由H2O2诱导的细胞氧化损伤,提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和谷胱甘肽水平。在所有指标测定中,组分C比组分D表现优越。这些实验结果表明分离纯化得到的多肽可以作为功能食品开发中的天然抗氧化原料,减少人们因氧化应激造成的健康问题。为了进一步阐明分离纯化的多肽对细胞抗氧化的保护机制,实验结果表明,多肽组分对细胞氧化应激损伤的抑制机理是通过Nrf2核转位途径来刺激Nrf2-ARE信号通路,上调第二阶段解毒酶的表达水平,包括血红素氧合酶-1、醌NADH脱氢酶1和谷胱甘肽S-转移酶,继而激活细胞内部抗氧化保护系统,达到了保护细胞免受氧化损伤的目的。利用纳米液相色谱-串联质谱法（电子喷雾电离检测器）从组分C和D中分别鉴定了四种肽段。这些肽段由多种疏水性氨基酸组成,具有抗氧化特征。通过查询比对美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库可知,这些鉴定出的肽段和两种双孢菇具有1 00%的同源性。