DNA双链断裂(double-strand breaks，DSBs)是一种最严重的DNA损伤类型，它会造成基因组的不稳定并导致细胞死亡。现有研究揭示了两种主要的修复途径：同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。参与NHEJ途径的核心成分在酵母和人中都高度保守。在人类细胞周期中，NHEJ修复途径占据主导地位。长期以来，NHEJ修复系统被认为仅存于真核生物，近期研究发现在原核生物中也存在此修复途径。真核生物的NHEJ系统有大量的蛋白参与，而细菌的NHEJ系统目前只发现两种蛋白：即DNA结合蛋白Ku和一种多功能的DNA连接酶(LigD)，但具体的作用机制尚不清楚。　　 本研究以耻垢分枝杆菌M. smegmatis做为模式生物来探讨原核生物的NHEJ修复机制，同时期望有助于深入了解真核的NHEJ机制。为了发现参与NHEJ系统的新蛋白因子，本论文设计以该系统中已知的核心元件Ku作为诱饵蛋白，利用串联亲和纯化(tandemaffinity purification.TAP)的方法从蛋白组中垂钓出相互作用的蛋白。经过质谱鉴定，发现了一个新的与Ku相互作用的蛋白：NAD-dependent deacetylase。蛋白同源序列比对显示它属于生物界中高度保守的一类蛋白Sir2，将其命名为Msm-Sir2。SBP pull-down实验和far-western blot分析再次验证了它们之间的相互作用。利用同样的方法，不仅证实了结核分枝杆菌M.tuberculosis中存在同样的相互作用，而且与Sir2相互作用的位点存在于Ku蛋白序列的保守区域，表明Sir2与Ku的相互作用非常保守。　　 由于首次发现了原核生物的Sir2与Ku之间存在着相互作用，研究Sir2与LigD之间是否也存在着相互作用就显得尤为重要。通过体外相互作用实验分析，揭示了Sir2与LigD之间也存在相互作用，加上首次发现的Ku与Sir2之间的相互作用和已知的Ku与LigD之间的相互作用，暗示着Sir2除了直接与Ku和LigD相互作用外，还可能调节Ku与LigD之间的相互作用。这也进一步说明了Sir2在NHEJ系统中的重要性。　　 Sir2蛋白是依赖NAD+的去乙酰化酶，这类蛋白从细菌到人都相当保守。在酵母中，Sir2/3/4复合物与Ku有相互作用，并间接地参与NHEJ。为了研究Sir2在分枝杆菌的NHEJ系统中的功能，首先从基因组上分别敲除sir2和ku，然后利用基于质粒的体内验证体系研究突变株对NHEJ的影响。数据显示，双链修复效率在sir2突变株中降低了两倍，而ku突变株的双链修复效率急剧下降。这说明Sir2在NHEJ系统中起着重要的作用，但功能不如Ku重要。　　 另外，通过质粒过量表达Sir2，能够下调Ku的内源性蛋白表达水平，并且这种下调不依赖于转录调控。而过量表达Ku对Sir2的蛋白水平没有影响，这说明Sir2的过量表达对Ku起到负向调控的作用。有趣的是，Sir2的过量表达使NHEJ修复效率升高2倍，而预期的结果应该是随着Ku的蛋白水平的降低而减弱。这种较高的NHEJ效率伴随着较低水平的Ku蛋白，说明过量表达的Sir2在某种程度上弥补了Ku的不足，也更加显示出Sir2对NHEJ系统的重要性。　　 本研究首次报导了Sir2作为一个全新的NHEJ蛋白因子，直接参与原核生物的NHEJ途径。