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菊粉(inulin)是D-呋喃果糖分子由β-2,1-糖苷键连接组成的链状多糖，其末端有一个葡萄糖残基以α-2,1-糖苷键与之相连。菊粉广泛存在于菊芋(Jerusalemartichoke)、雪莲果(Yacon)、菊苣(Chicory tubes)和牛蒡(Arctium)等多种植物中。菊粉酶(inulinase)是一种呋喃果糖基水解酶，它靶向作用于菊粉中的β-2,1糖苷键并将其水解为果糖和葡萄糖。菊粉酶可以分为外切菊粉酶和内切菊粉酶。外切菊粉酶可以从菊粉分子的非还原末端催化水解下-D-呋喃果糖残基,其底物可为菊粉、蔗糖、果聚糖；内切菊粉酶可以水解菊粉内部的β-2,1糖苷键使其变成菊糖三糖、菊糖四糖、菊糖五糖为主的低聚果糖。在本研究中为了了解海洋酵母菌菊粉酶基因及其功能和应用，分别克隆了海洋隐球酵母Cryptococcus aureus HYA菌株的菊粉酶基因和海洋酵母Candida membranifaciens subsp.flavinogenie W14-3菌株的菊粉酶基因，同时将从C.aureus HYA菌株克隆得到的菊粉酶基因HYAINU1分别在Pichia pastoris和Saccharomyces cerevisiae中表达。C. aureus HYA菌株具有菊粉酶活性，从C.aureus HYA菌株中克隆的菊粉酶基因HYAINU1基因登录号为JX073660，该菊粉酶基因的ORF框共1653bp，基因中不含内含子，翻译550个氨基酸，氨基酸序列中的前23个为信号肽部分，蛋白预测分子量大小为59.5kDa。在该菊粉酶氨基酸序列中含有酵母外切菊粉酶的保守序列WMNDPNGL、RDP、ECP、FS和Q，同时含有2个N-糖基化位点。在启动子中含有1个TATA框、2个5′-SYGGRG-3′序列，若干5′-CGG-3′序列。5′-SYGGRG-3′序列是Mig1中C2H2锌指蛋白的锚定位点，说明该基因表达受到葡萄糖阻遏。而5′-CGG-3′序列是转录激活蛋白Zn(II)2Cys6的锚定位点，说明该基因表达受到底物诱导。将菊粉酶基因HYAINU1去掉信号肽部分，连接到pPICZaA表达载体中，在巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33中表达。表达的融合蛋白通过不连续SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot分析验证，得到蛋白分子量大小为60.0kDa左右的目的条带。含有HYAINU1基因的P. pastoris X-33转化子在培养过程中，培养液中测得的最高菊粉酶酶活力单位为16.3±0.24U/mL。该重组菊粉酶最适反应温度为50℃，最适pH值为5.0。纯化的重组菊粉酶水解菊粉后发现大量单糖，说明C. aureus HYA菌株分泌的菊粉酶为外切菊粉酶。将菊粉酶基因HYAINU1连接到pMIRSC11表达载体中在高产酒精酵母W0菌株的尿嘧啶缺陷型菌株W12d中表达，筛选后得到转化子MHYAINU1-69。该转化子培养到72h时酶活力为19.2±0.3U/mL。经150mL体系的酒精发酵研究确认最佳接种量和最适菊粉浓度分别为10.0%(v/v)和25.0%(w/v)，当发酵到120h时，酒精浓度可达到11.9%(v/v，20°C)。当扩大到3-L发酵体系，发酵时间为120h时发酵液酒精浓度为13.1±0.6%(v/v，20°C)。分离自中国东海表层海水样品的海洋酵母C.membranifacienssubsp.flavinogenie W14-3菌株可分泌核黄素，但也具有菊粉酶活性，W14-3菌株菊粉酶基因的基因登录号为KC576811。该菊粉酶基因的ORF框共1536bp，翻译512个氨基酸，通过软件EditSeq预测的蛋白分子量大小为57.8kDa。W14-3菌株的菊粉酶基因5′端上游序列的非编码区中除含启动子外还存在2个5′-SYGGRG-3′序列及若干5′-CGG-3′序列，说明W14-3菌株菊粉酶基因的表达同样受到葡萄糖的阻遏和底物的诱导。