研究背景及目的随着经济的快速发展,环境问题日益严重,人口增长以及老龄化程度的提高,癌症已经称为我国目前重大的公共卫生问题之一。根据《Cancer Statistics in China,2015》的统计数据显示,乳腺癌高居我国女性常见癌症的首位,致死率位列前茅。目前,在临床上主要采用常规的手术治疗、放疗、化疗、激素治疗、内分泌治疗及中药治疗等方式进行乳腺癌的治疗,但仍未获得令人满意的疗效。因此,乳腺癌的防治一直是生物医学领域的重大课题。声动力学疗法(Sonodynamic Therapy,SDT)利用超声的组织穿透能力强、传播过程中能量衰减小的特点,有效地将能量聚焦于深部组织,协同富集于肿瘤组织的声敏剂发挥杀伤效应,是肿瘤超声治疗的一种方法。超声与声敏剂的联合使用,降低了声致细胞死亡的作用阈值的同时,激活低毒/无毒的声敏剂分子,特异性损伤肿瘤组织,而对机体正常的组织器官无明显影响。尤其是对于一些手术治疗困难、晚期癌症的姑息治疗的患者,SDT因其治疗的靶向性、安全性、微创性和临床实践的可行性,可以作为重要的治疗备选手段。SDT涉及医学、生物、物理及化学等多个领域,国内外学者从不同角度开展了多项研究,包括声敏剂的开发、超声设备的研制、作用机理的研究等。同时,探索如何增效SDT以获得更为显著的抗肿瘤效应也是研究的重点之一。超声微泡靶向爆破(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)技术是近年来凸显的药物递送系统研究的热点。研究表明,UTMD可以促进声敏剂在病灶局部的释放,并增强其SDT抗肿瘤活性。因此,本研究以我国自主研发的卟啉二聚体钠盐华卟啉钠(Sinoporphyrin sodium,DVDMS)为声敏剂,设计合成携载DVDMS的脂质体-微泡复合体(DVDMS-loaded Liposomes-Microbubbles complexes,DLMBs),对其超声介导下的药物释放特征进行分析;并以离体培养的乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌荷瘤模型为实验对象,开展UTMD增效SDT抗肿瘤作用的初步研究,旨在为探索运用UTMD实现声敏剂控释、提升SDT抗乳腺癌的疗效提供有价值的理论依据和实验基础。研究方法及结果:1.选用合成磷脂DPPC、DSPE-PEG 2000-Biotin及胆固醇为材料,采用薄膜水化-超声分散法制备DVDMS脂质体。以脂质体的粒径、包封率为指标,考察膜材各组分比例、DVDMS用量等因素,优化DVDMS脂质体的合成工艺,从而获得粒径较小、分散性好、包封率高的脂质体。经测定,制备得到的DVDMS脂质体平均粒径为(150.8 ± 23.3)nm,DVDMS的包封率为(68.73 ± 6.99)%,在96 h内DVDMS脂质体保持相对稳定。选用合成磷脂DPPC、DSPE-PEG 2000-Biotin及胆固醇为材料,采用薄膜水化-机械振荡法制备脂质微泡。以微泡粒径为主要考察指标,优化合成工艺,获得粒径较小、分散性好的脂质微泡。经测定,制备得到的微泡平均粒径为(733.5 ±49.2)nm,在24 h内保持相对稳定。2.生物素-亲和素系统(Biotin-avidin system,BAS)是利用生物素与亲和素的特异性结合,具有高灵敏度、高特异性及高稳定性的特点,被广泛用于纳米药物的合成研究中。本研究中采用BAS将生物素化的DVDMS脂质体与微泡进行连接。通过优化合成反应中亲和素剂量、脂质体及微泡的使用量,制备得到DLMBs平均粒径为(1009.2 ±62.81)nm,DVDMS的包封率为(40.67 ±8.43)%。根据激光扫描共聚焦显微镜观察结果推断DVDMS脂质体连接于微泡的壳膜上;流式细胞仪检测结果表明在制备得到的DLMBs悬液中,DVDMS脂质体能够有效连接到微泡上,二者的连接率为67.02%。3.在超声的作用下,DLMBs中携载的DVDMS能够有效释放,呈现出“超声突释”的特征,相对释放量随着超声作用强度的增强而提高。光镜下观察到超声处理后DLMBs中的含气囊泡结构近乎消失,提示超声有效破坏脂质体-微泡复合体的结构。对苯二甲酸法检测到超声处理后DLMBs悬液中羟自由基生成;相应地,通过FTC实验和MDA含量测定,发现处理后DLMBs悬液中脂过氧化水平升高。由以上结果推测在超声作用下微泡的急剧形变、崩解,空化作用导致氧自由基的大量产生,造成了脂质组分氧化,破坏了 DLMBs结构的完整性,促发声敏剂DVDMS的释放。4.以离体培养的人乳腺癌MDA-MB-231细胞为实验模型,分析DLMBs联合超声对乳腺癌细胞的体外杀伤效应。实验设定以游离DVDMS、普通DVDMS脂质体为对照,对比分析DLMBs联合超声对肿瘤细胞损伤效应;并以不同DLMBs用量、不同超声强度条件作用于肿瘤细胞,研究DLMBs联合超声杀伤肿瘤细胞的作用规律。在此基础上,选择半数抑制肿瘤细胞存活率的实验参数用于后续的实验研究。5.DLMBs结合超声共同作用于MDA-MB-231细胞,与游离DVDMS、普通DVDMS脂质体相比较,能够更大程度地杀伤乳腺癌细胞。扫描电子显微镜观察到DLMBs联合超声作用后,细胞表面结构显著改变,发生严重形变。克隆形成率实验结果显示,联合作用超声能够显著抑制细胞的增殖能力。流式细胞仪检测可知联合处理后细胞凋亡率明显提高,线粒体膜电位显著降低。同时,细胞内活性氧生成量增多;抑制剂实验结果显示活性氧参与了 DLMBs联合超声对乳腺癌细胞的杀伤过程。6.建立小鼠乳腺癌4T1荷瘤模型。通过自体对照实验分析DLMBs联合超声作用后DVDMS在肿瘤组织中的含量。一方面,以尾静脉注射的方式向荷瘤小鼠给予DLMBs,并对一侧移植瘤进行超声处理。小动物活体成像观察和荧光分光光度法检测的结果显示,与未经处理的一侧肿瘤组织相比,经超声辐照后的肿瘤组织中含有较多的DVDMS,这提示以DLMBs结合超声作用后可以提高DVDMS在肿瘤组织中的含量。另一方面,借助于小鼠立体定位仪向荷瘤小鼠的肿瘤组织原位注射DLMBs,超声处理后进行连续的冰冻切片,荧光体视显微镜观察肿瘤组织中DVDMS的分布情况,发现未经超声处理的组织中DVDMS荧光聚集于一处,而处理后组织中DVDMS弥散分布的范围明显扩大。由以上结果可以推测DLMBs联合超声能够促进声敏剂DVDMS在肿瘤组织中的富集和扩散,利于其介导的SDT更好地发挥抗肿瘤作用。7.以小鼠乳腺癌4T1移植瘤为实验模型,分析DLMBs联合超声对肿瘤抑制作用。对肿瘤生长情况及瘤重的测定结果表明,与游离DVDMS及普通DVDMS脂质体比较,DLMBs协同超声能够更为显著地抑制移植瘤的生长。H&E染色结果显示出DLMBs联合超声可以造成肿瘤组织更大程度的损伤。TUNEL染色及PCNA免疫组织化学分析表明联合处理显著诱导了肿瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖能力。同时,在整个治疗的过程中,荷瘤小鼠体重无明显变化,组织切片观察显示该治疗方式对主要脏器无明显的副作用。