论文部分内容阅读
膀胱癌是我国泌尿外科最常见的恶性肿瘤，且发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位。近期研究发现，肥胖相关基因(fat mass and obesity associated, FTO)编码的蛋白具有RNA去甲基化酶功能，并在脂肪形成、精子形成、发育、癌变、干细胞更新和其它疾病中起调控作用。目前，RNA去甲基化酶FTO对膀胱癌发生及发展的影响尚未明确。 目的: 探讨RNA去甲基化酶FTO在膀胱癌细胞中的表达情况及其功能，为膀胱癌RNA表观遗传调控研究奠定新的理论基础，为膀胱癌RNA表观遗传防治提供新的策略。 方法: 1．检测人膀胱癌组织与对应癌旁组织中FTO基因表达水平，选取24组配对的膀胱癌组织及癌旁组织，通过实时定量PCR检测FTO在膀胱癌组织和对应癌旁组织中表达量是否存在差异。 2．检测人正常膀胱细胞株和膀胱癌细胞株FTO蛋白表达水平，选取人膀胱移行上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞T24、5637和J82，采用Western blot检测人永生化膀胱移行上皮细胞和各膀胱癌细胞系中FTO的蛋白表达差异。 3．构建敲除FTO和过表达FTO载体，化学合成FTO基因3条靶向敲除序列(sp1， sp2，sp3)，连接到PX458质粒上，转染至293T细胞，提取基因组DNA采用T7E1实验筛选切割效率最高的靶序列，连接到LentiCRISPRV2慢病毒敲除质粒上构建敲除FTO的LentiCRISPRV2-FTO载体；使用PCR仪扩增FTO基因CDS区全长，连接到PLEX慢病毒过表达质粒上构建过表达F TO的PLEX-FTO载体。 4．建立敲除FTO和过表达FTO的稳定细胞株，将LentiCRISPRV2-FTO和PLEX-FTO分别转染至293T细胞生产病毒液，感染SV-HUC-1细胞和T24细胞，加入嘌呤霉素筛选阳性克隆株，并采用有限稀释法挑取敲除FTO的单克隆细胞株，建立敲除FTO基因的稳定细胞株 SV-HUC-1-V2-FTO和过表达 FTO基因的稳定细胞株T24-PLEX-FTO。采用基因测序检测SV-HUC-1-V2-FTO细胞在基因水平敲除FTO，并采用 Western blot检测 SV-HUC-1-V2-FTO和 T24-PLEX-FTO细胞在蛋白水平FTO表达。 5．采用斑点印迹检测SV-HUC-1和T24细胞RN A上6-甲基腺嘌呤（ m6A）的表达水平，并检测敲除FTO对膀胱上皮细胞及过表达F TO对膀胱癌对m6 A水平的影响。 6．敲除FTO对膀胱上皮细胞和过表达FTO对膀胱癌细胞表型影响。MTS法和细胞集落实验检测细胞增殖情况；细胞划痕实验检测细胞迁移能力；Matrigel模拟细胞侵袭时穿越的膜结构检测细胞侵袭能力；流式细胞仪法分别检测细胞周期和细胞凋亡；并使用Western blot检测凋亡相关通路Caspase蛋白的表达。 7.统计学方法，上述所有的实验数据来自三次独立重复的实验结果。使用Grap hPad Prism6软件进行绘图。统计学分析采用SPSS18.0软件进行，数据采用平均值±标准差的形式表示，三组数据采用单因素方差分析（ AN O VA），两组数据间比较采用Dunnett-t检验进行分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。 结果: 1．实时定量PCR检测24对标本发现，与对应癌旁组织相比，FTO基因在膀胱癌组织中相对低表达（P<0.05）。 2．Western blot检测人膀胱移行上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞T24、5637和J82，发现FTO在膀胱上皮细胞SV-HUC-1中表达最高，在膀胱癌细胞T24中表达最低。 3．测序验证成功构建敲除FTO的LentiCRISPRV2-FTO和过表达FTO PLEX-FTO载体。 4．基因测序检测SV-HUC-1-V2-FTO细胞在基因水平敲除FTO， Western blot检测SV-HUC-1-V2-FTO细胞FTO蛋白表达缺失，T24-PLEX-FTO细胞FTO蛋白表达显著增加。成功构建了敲除FTO基因的SV-HUC-1-V2-FTO稳定细胞株和过表达FTO的T24-PLEX-FTO稳定细胞株。 5．斑点印迹检测发现 T24细胞比 SV-HUC-1细胞的 m6A水平相对较高，并且SV-HUC-1-V2-FTO比 SV-HUC-1-V2-contro l组 m6A表达水平显著增加，而T24-PLEX-FTO比T24-PLEX-control细胞m6A表达水平显著降低。 6．MTS检测结果表明，SV-HUC-1-V2-FTO组比SV-HUC-1-V2-contro l组细胞增殖速度增加，而T24-PLEX-FTO组比T24-PLEX-control组细胞增殖速度减慢；细胞集落实验检测结果表明 SV-HUC-1-V2-FTO组比 SV-HUC-1-V2-contro l组细胞克隆能力增强，而T24-PLEX-FTO组比T24-PLEX-control组细胞克隆能力减弱；划痕实验和划痕上加入Matr ige l分别检测细胞迁移和侵袭能力，结果表明在0 h时，各组细胞划痕面积基本相等，在24 h SV-HUC-1-V2-FTO组的划痕愈合面积大于SV-HUC-1-V2-contro l组，而 T24-PLEX-FTO组的划痕愈合面积小于T24-PLEX-co ntro l组；流式细胞法检测各组细胞周期结果显示， SV-HUC-1-V2-FTO组比 SV-HUC-1-V2-contro l组 G0/G1期减少，S期增加，而T24-PLEX-FTO组比T24-PLEX-control组G0/G1期增加，S期减少；流式细胞法检测各组细胞凋亡水平，结果显示SV-HUC-1-V2-FTO组比SV-HUC-1-V2-contro l组凋亡率减少，而T24-PLEX-FTO组比T24-PLEX-control组凋亡率增加；Western blo t检测各组细胞 Caspase通路蛋白表达显示， SV-HUC-1-V2-FTO组比SV-HUC-1-V2-control组剪切后Caspase-9、Caspase-3和PARP蛋白表达下降，而T24-PLEX-FTO组比 T24-PLEX-control组剪切后Caspase-9、Caspase-3和PARP蛋白表达增加。 结论: 1.与对应癌旁组织相比，人膀胱癌组织FTO相对低表达，并与病理分期分级呈负相关。人膀胱癌细胞相比人膀胱上皮细胞，FTO呈相对低表达。 2. RNA去甲基化酶FTO具有降低膀胱癌细胞m6A的修饰水平作用。 3. RNA去甲基化酶FTO能够通过诱导细胞G0/G1阻滞和凋亡从而抑制膀胱癌细胞生长，并抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。